Giardia duodenum - бұл лямблиозды тудыратын паразиттік организм, әсіресе диареяның клиникалық белгілері бар жас балаларда жиі кездесетін ішек инфекциясы.Біз бұрын жасушадан тыс G. duodenalis жасушаішілік олигомеризацияға ұқсас рецептор 3 (NLRP3) байланыстыратын нуклеотидтердің белсендірілуін қоздыратынын және жасушадан тыс везикуланың (EV) секрециясы арқылы иесінің қабыну реакцияларын реттейтінін хабарлаған болатынбыз.Дегенмен, осы процеске қатысатын патогенмен байланысты дуоденококк EV (GEV) нақты молекулалық үлгілері және лямблиоздағы NLRP3 қабынуының рөлі әлі де анықталуы керек.
GEV ішіндегі рекомбинантты эукариоттық экспрессиялық плазмидалар pcDNA3.1(+)-альфа-2 және альфа-7.3 лямбидтері құрылды, тінтуірдің бастапқы перитонеальді макрофагтарына трансфекцияланды және каспаза-1 қабынудың нысана молекуласын өлшеу арқылы анықталды.p20 өрнек деңгейі экранға шығарылды..G. duodenalis альфа-2 және альфа-7,3 лямбриндері бастапқыда NLRP3 қабынуын (NLRP3, про-интерлейкин-1 бета [IL-1β], про-каспаза-1 және каспас-1 p20), IL секрециясын өлшеу арқылы анықталды.1β деңгейлері, апоптотикалық нүктелі ақуыз (ASC) олигомеризация деңгейлері және NLRP3 және ASC иммунофлуоресцентті локализациясы.Содан кейін G. duodenalis патогенділігіндегі NLRP3 қабынуының рөлі NLRP3 белсендіруі бұғатталған (NLRP3 блокталған тышқандар) және дене салмағының патологиялық өзгерістері, ұлтабар паразиттік жүктемесі және он екі елі ішек тіндері бақыланатын тышқандар арқылы бағаланды.Сонымен қатар, біз альфа-2 және альфа-7.3 хиардиндері NLRP3 қабынуы арқылы in vivo IL-1β секрециясын индукциялайтынын зерттедік және бұл молекулалардың тышқандардағы G. duodenalis патогенділігіндегі рөлін анықтадық.
Альфа-2 және альфа-7,3 лямбриндері in vitro NLRP3 қабынуының белсендірілуін тудырады.Бұл p20 каспаза-1 белсендірілуіне, NLRP3, pro-IL-1β және pro-caspase-1 белоктарының экспрессия деңгейлерінің жоғарылауына, IL-1β секрециясының айтарлықтай артуына, АСҚ дақтарының пайда болуына әкелді. цитоплазма және ASA олигомеризациясының индукциясы.NLRP3 қабынуы Жыныс мүшесінің жоғалуы тышқандардағы G. duodenalis патогенділігін күшейтеді.NLRP3-блокталған тышқандардан гаваж арқылы кисталармен өңделген тышқандарда трофозоиттердің көбеюі және он екі елі ішектің бүршіктерінің ауыр зақымдануы байқалды, олар жиырылған және тармақталған некротикалық крипттермен сипатталады.In vivo тәжірибелері лямбдиндер альфа-2 және альфа-7.3 NLRP3 қабынуы арқылы IL-1β секрециясын индукциялай алатынын көрсетті, ал альфа-2 және альфа-7.3 лямбидтерімен иммундау тышқандардағы G. duodenalis патогенділігін төмендетті.
Біріктірілген бұл зерттеудің нәтижелері лямблиоздың альфа-2 және альфа-7.3 иесінің NLRP3 қабынуының жоғарылауын тудырады және тышқандардағы G. duodenalis жұқпалылығын төмендетеді, бұл лямблиоздың алдын алудың перспективалы мақсаттары болып табылады.
Лямблия он екі елі ішек – жасушадан тыс қарапайым паразит, ол аш ішекте өмір сүреді және жыл сайын, әсіресе дамушы елдердегі жас балалар арасында диареямен бірге лямблиоздың 280 миллион жағдайын тудырады [1].Адамдар M. ұлтабар кисталарымен ластанған ауыз су немесе тағам арқылы жұқтырылады, содан кейін олар асқазанға түсіп, асқазан сөлімен бірге шығарылады.Лямблия он екі елі ішектің трофозоиттері ұлтабар эпителийіне жабысып, жүрек айнуын, құсуды, диареяны, іштің ауырсынуын және салмақ жоғалтуды тудырады.Иммунитет тапшылығы және муковисцидозы бар адамдар инфекцияға бейім.Инфекция ауызша және анальды жыныстық қатынас арқылы да болуы мүмкін [2].Метронидазол, тинидазол және нитазоксанид сияқты препараттар он екі елі ішек инфекцияларын емдеудің қолайлы нұсқалары болып табылады [3].Дегенмен, бұл химиотерапиялық препараттар жүрек айнуы, канцерогенез және генотоксичность сияқты жағымсыз жанама әсерлерді тудырады [4].Сондықтан G. duodenalis инфекциясының алдын алу үшін тиімдірек стратегияларды әзірлеу қажет.
Қабынулар – туа біткен иммундық жауаптың бөлігі болып табылатын, патогендік инвазиядан қорғануға және қабыну реакцияларына делдалдық жасауға көмектесетін цитозолдық ақуыз кешендерінің класы [5].Осы қабынулардың арасында нуклеотидті байланыстыратын олигомеризация (NOD) рецепторы 3 (NLRP3) нуклеотидті байланыстыратын олигомеризация (NLRP3) нуклеотидті байланыстыратын қабыну тәрізді қабыну жан-жақты зерттелген, себебі оны әртүрлі патоген/зақыммен байланыстырылған ПАМП үлгісімен анықтауға болады. DAMP), туа біткен иммундық жүйені таниды, белсендіреді.және көптеген қабыну ауруларында ішек гомеостазын реттейді [6,7,8].Ол үлгіні тану рецепторынан (PRR) NLRP3, адаптер апоптотикалық нүктелі ақуыздан (ASC) және эффекторлық прокаспаза-1 немесе прокаспаза-11 тұрады.NLRP3 қабынуы Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] және Leishmania зерттеулерінде байқалғандай патогендік инвазияға қарсы хост ретінде әрекет етеді.[11], бірақ сонымен қатар NLRP3 қабынуының белсендірілуі қорғаныш иммундық жауаптарды шектейді және аурудың дамуын күшейтеді, мысалы, құрттарда [12].Біздің алдыңғы нәтижелерімізге сүйене отырып, біз жасушадан тыс G. duodenalis NLRP3 қабынуының жасушаішілік белсендірілуін қоздыратынын және жасушадан тыс көпіршіктерді (EVs) секрециялау арқылы қожайынның қабыну реакцияларын модуляциялайтынын хабарладық [13].Дегенмен, in vivo G. duodenalis инфекциясындағы NLRP3 қабынуының рөлі әлі де анықталуда.
Бастапқыда лямбильдер G. duodenalis цитоскелетінің құрылымдық құрамдас бөліктері ретінде сипатталды және трофозоит қозғалғыштығында және аш ішекте эпителий жасушаларының бекітілуінде маңызды рөл атқарады.Қоршаған ортаға жақсы бейімделу және олардың патогенділігін арттыру үшін G. duodenalis trophozoites 8 жілік, 1 ортаңғы дене және 1 қарынша дискіден тұратын ерекше цитоскелеттік құрылымды жасады [14].Giardia duodenum трофозоиттері өздерінің цитоскелеттерін жоғарғы жіңішке ішекке, әсіресе он екі елі ішекке еніп, энтероциттерге бекіну үшін пайдаланады.Олар жасуша метаболизмі арқылы эпителий жасушаларына үнемі қоныс аударады және бекітіледі.Сондықтан олардың цитоскелеті мен вируленттілігі арасында тығыз байланыс бар.Giardia duodenum-ға тән лямблиналар цитоскелеттік құрылымның құрамдас бөліктері болып табылады [15] және төрт класқа бөлінеді: α-, β-, γ- және δ-лямблиялар.α-гиардиндер тұқымдасының 21 мүшесі бар, олардың барлығының фосфолипидтерді байланыстыру үшін кальцийге тәуелді қабілеті бар [16].Олар сонымен қатар цитоскелетті жасуша мембранасымен байланыстырады.G.duodenalis тудырған диареямен ауыратын адамдарда α-лямбяндар жоғары экспрессияға ие және инфекция кезінде иммунореактивті болады [17].Giardia alfa-1 негізіндегі гетерологиялық вакциналар тышқандардағы лямблиоздан қорғалған және вакцинаны әзірлеуге ықтимал кандидат антигендер болып табылады [18].Вентральды дискіде емес, плазмалық мембранада және жгутикада локализацияланған альфа-8 лямбильді G. duodenalis-те трофозоиттердің қозғалғыштығы мен өсу жылдамдығын күшейтеді [19].Альфа-14 гиардин жгутикадағы микротүтікше құрылымдарға бекітіледі және G. duodenalis өміршеңдігіне әсер етеді [20].Альфа-11 лямбдині өмірлік циклде көп мөлшерде болады, ал альфа-11 лямбидінің шамадан тыс экспрессиясы G. duodenalis-тің өзін зақымдайды [21].Дегенмен, альфа-2 гиардин мен альфа-7,3 лямдин G. duodenalis инфекциясынан және олардың негізгі механизмдерінен қорғайтыны белгісіз.
Бұл зерттеуде рекомбинантты эукариоттық экспрессия плазмидалары pcDNA3.1(+)-альфа-2 ляардин және pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 ляардин NLRP3 хостын белсендіру үшін тінтуірдің бастапқы перитонеальді макрофагтарына трансфекцияланды.Содан кейін қабыну нысандары тексерілді.Біз сондай-ақ G. duodenalis патогенділігіндегі NLRP3 қабынуының рөлін бағаладық, альфа-2 және альфа-7,3 лямбомасомасының in vivo NLRP3 қабынуының активтенуін индукциялайтынын зерттедік және лямбомасоманың патогенділігіндегі осы екі рөлін анықтадық. G. duodenalis.Біздің ортақ мақсатымыз G. duodenalis инфекциясының алдын алу бойынша перспективалық мақсаттарды әзірлеу болды.
Жабайы типті (WT) C57BL/6 5–8 апталық аналық тышқандар Ляонин Чаншенг эксперименттік жануарлар орталығынан (Ляонин, Қытай) сатып алынды.Тышқандар суға еркін қол жеткізе алды, зарарсыздандырылған тағам алды және 12/12 сағаттық жарық/қараңғы циклде ұсталды.Жұқтырмас бұрын тышқандар ампициллинмен (1 мг/мл), ванкомицинмен (1 мг/мл) және неомицинмен (1,4 мг/мл) (барлығы Шанхайдан, Қытайдан сатып алынған, жасанды организмдер) қосылған ауыз судағы антибиотиктерді ad libitum алды [22] ].].> 24 сағат бойы жеу және ішу қабілетін жоғалтқан және дене салмағының ≥ 20% жоғалтқан тышқандар жатыр мойнының дислокациясы арқылы эвтанизацияланған.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) 12,5% ұрықтың сиыр сарысуымен (FBS; Every Green, Чжэцзян, Қытай) және 0,1% сиыр өтімен (Сигма-Олдрих, Сент-Миссури, АҚШ) толықтырылды. ).АҚШ) микроаэробты жағдайда.Біріктірілген трофозоиттер мұзда жиналып, одан әрі көбею үшін 1:4 қатынасында өтті.
Лямблия он екі елі ішек кисталары бұрын сипатталғандай индукцияланды [23], трофозоиттер логарифмдік фазада жиналды, содан кейін рН 7,1 (түрлендірілген TYI-S-33) инкапсуляциялық индукциялық ортамен 1 × 106 трофозоит/мл соңғы концентрацияға дейін сұйылтылды.өт концентрациясы 0,05% орта).Трофозоиттер анаэробты жағдайда 37°С температурада логарифмдік өсу фазасына дейін өсірілді.Ортаны киста индукциялаушы ортаға (рН 7,8; ​​өт концентрациясы 1% модификацияланған TYI-S-33 ортасына) және G. duodenalis культурасына 37°C температурада 48–96 сағатқа ауыстырыңыз, оның барысында микроскоппен түзіліс кисталары байқалды.Трофозоиттердің көпшілігі кисталар түзу үшін индукцияланғаннан кейін, культура қоспасы жиналды және қалған трофозоиттерді лизисі үшін стерильді деионизацияланған суда қайта суспензияланды.Тышқандардағы асқазан түтігі арқылы кейінгі талдаулар үшін кисталар саналып, 4°C температурада сақталды.
Лямблия жасушадан тыс көпіршіктері (GEVs) бұрын сипатталғандай байытылған [13].Логарифмдік өсу фазасындағы трофозоиттер экзосомасы азайған FBS (Biological Industries, Бейт-Хаемек, Израиль) дайындалған модификацияланған TYI-S-33 ортада 1 × 106 паразит/мл соңғы концентрациясына дейін қайта суспензияланды және 12 сағат бойы инкубацияланды.2000 г 10 минут, 10 000 г 45 мин және 100 000 г 60 минут бойы центрифугалау арқылы культура үстіңгі затынан бөлініп алынды.Тұнбалар фосфатты буферленген тұзды ерітіндіде (PBS) ерітілді, BCA протеинін талдау жинағы (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, АҚШ) көмегімен сандық мәндері анықталды және -80°C температурада сақталды немесе одан әрі талдаулар үшін тікелей пайдаланылды.
Бастапқы тышқанның перитонеальді макрофагтары бұрын сипатталғандай дайындалды [24].Қысқаша айтқанда, тышқандар (6-8 апталық) 2,5 мл 2,98% Difco сұйық тиогликоль ортасы (BD, Franklin Lakes, NJ, АҚШ) енгізілді (интраперитональды [ip]) және 3-4 таңдаймен қоректендірілді.Макрофагтардың суспензиясы эвтаназиядан кейін тышқандардың құрсақ қуысынан жиналды және 3 рет 1000 г-да 10 минут бойы центрифугаланды.Жиналған жасушалар CD11b маркері арқылы жасуша тазалығы >98% болғанша ағынды цитометрия арқылы анықталды, содан кейін 6-ұяшықты культуралық пластиналарға (4,5 x 106 жасуша/ұңғыма) қосылды және 37°C температурада 10% FBS (Bioindustry) инкубациялады.және 5% CO2.
РНҚ 1 мл TRIzol реагентінде (Вазыме, Нанкин, Қытай) 1 × 107 трофозоиттен алынды, MonScript dsDNase (Монад, Вухан, Қытай) көмегімен геномдық ДНҚ жалпы G. duodenalis РНҚ-дан алынды және комплементарлы ДНҚ (cDNA) синтезделді. өндірушінің нұсқауларына сәйкес MonScript RTIIII Super Mix (Monad) пайдалану.
Мақсатты G. duodenalis геніне арналған CDS реттілігі туралы ақпарат NCBI GenBank-тен алынды.Әрбір мақсатты ген үшін арнайы жіксіз клондау праймерлерін жобалау үшін Primer 5.0 пайдаланыңыз.Алдыңғы праймер (5′-3′) үш бөліктен тұрады: сызықтық pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) векторымен қабаттасатын тізбек және ATG және GNN бастау кодондары (бірінші негіз G болмаса).Бұл өрнектің тиімділігін арттыру үшін жасалады.Сонымен қатар, кем дегенде 16 б.қ аралас негіздер (GC мазмұны 40–60%/Тм шамамен 55 °C).Кері праймер (5′-3′) екі бөліктен, EcoRV-сызықтыланған pcDNA3.1(+) векторымен (GCCGCCACTGTGCTGGAT) қабаттасатын тізбектен және кемінде 16 бит құрайтын біріктірілген негізден тұрады.(соңғы екі аялдаманы қоспағанда).негіздер) рекомбинантты плазмидаларға таңбаланған ақуыздарын экспрессиялауға мүмкіндік беретін AA немесе GA сияқты кодон).Праймер тізбегі 1-кестеде келтірілген және оларды Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Чанчун, Қытай) синтездеген.
Үлгі ретінде дайындалған G. duodenalis cDNA көмегімен нысаналар Pfu ДНҚ полимеразасы (Тянген, Пекин, Қытай) немесе Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Пекин, Қытай) арқылы күшейтілді.Эукариоттық экспрессия векторы pcDNA3.1(+) плазмидасы EcoRV шектеу ферментімен сызықтандырылды және Fast AP (Thermo Fisher Scientific) көмегімен фосфорсыздандырылды.Сызықты pcDNA3.1(+) фрагменттері мен күшейтілген мақсатты ген фрагменттері ДНҚ гелін тазарту жинағы (Тянген) арқылы тазартылды және Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) көмегімен сандық мәндері анықталды.pcDNA3.1(+) фрагменті және әрбір мақсатты ген фрагменті MonClone бір жинақты клондау қоспасы (Monad Biotech Co., Ltd., Сучжоу, Қытай) арқылы қайта біріктірілді және Comate Bioscience Company Limited (Чанчун, Қытай) арқылы ДНҚ секвенирлеуімен расталды..
Эндотоксинсіз pcDNA3.1(+)-альфа-2 және pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 плазмидалары SanPrep эндотоксинсіз плазмидтік шағын жинақ (Sangon Biotech) көмегімен жасалды.Элюция буферіндегі ЭДТА трансфекциялық талдауға кедергі келтірмеуін қамтамасыз ету үшін концентрация 500 нг/мкл-ден жоғары деңгейде ұсталды.Бастапқы тышқанның перитонеальді макрофагтары толық RPMI 1640 (Biological Industries) ортасы бар 6 шұңқырлы пластиналарда 12 сағат бойы өсірілді, содан кейін пенициллин мен стрептомицинді жою үшін жасушалар жылы PBS-де 3 рет жуылды, содан кейін толық ортамен толықтырылған ортада.Эндотоксинсіз pcDNA3.1(+)-альфа-2 және pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 (2.5 мкг) плазмидтер 125 мкл Opti-MEM төмендетілген сарысу ортасында сұйылтылған (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Содан кейін 5 мкл Lipofectamine 2000 трансфекциялық реагент (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 125 мкл төмен сарысулық Opti-MEM ортасында сұйылтылған.Сұйылтылған эндотоксинсіз плазмидті Lipofectamine 2000-мен араластыру және қоспаны бөлме температурасында 5 минут тұруға мүмкіндік беру арқылы липосома-ДНҚ кешендерін дайындаңыз.Кешендерді әр шұңқырдағы ұяшықтарға бөлек өткізіп, баяу араластырыңыз.4 сағаттан кейін жасуша қоректік ортасы 2 мл толық RPMI 1640 ортасына ауыстырылды және культура 24 сағат бойы жалғасты.Жасушаларға жаңа піскен культура ортасы қосылды және талдау дизайнына байланысты әртүрлі уақыт нүктелері үшін инкубацияланды.
Супернатанттар мен жасуша лизаттарынан алынған ақуыз үлгілері бұрын сипатталғандай дайындалды [25].Pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-актин және His-тегі үшін мембрананы тасымалдау параметрлері 200 мА/90 мин болды.Интерлейкин 1β (IL-1β; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, АҚШ), каспаза-1 (p20) (Adipogen, Швейцария) және NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Швейцария) және 1:5000 үшін His tagenci (Amtifilet) Ухань, Қытай) және β-актин (Proteintech, Вухан, Қытай).
Дискцинимид субератымен (DSS) кросс-байланыс бұрын сипатталғандай орындалды [26].Жасушалар 3 рет суық PBS көмегімен жуылды және құрамында 25 мМ Na2PO4, 187,5 мМ NaCl, 25 мМ HEPES және 125 мМ NaHCO3 бар 50 мкл ASC реакция буферінде (рН 8,0) 27 калибрлі инемен толығымен лизингке ұшырады.Қоспа 5000 г температурада 3 минут бойы центрифугаланған және түйіршік 10 мкл DSS (DMSO-да 25 мМ) және 40 мкл ASC реакция буферімен 30 минут бойы 37°C температурада тігілген.10 минут бойы 5000 г центрифугалаудан кейін түйіршік 40 мкл ASC реакция буфері және 10 мкл 6x ақуызды жүктейтін буфер (TransGen, Пекин, Қытай) ерітіндісінде ерітілді, содан кейін ерітінді бөлме температурасында 15 минут бойы сөндірілді. мин., Содан кейін 10 минут қайнатыңыз.Протеин үлгілері содан кейін 1:500 сұйылту қатынасында бастапқы анти-ASC антиденелерін (Ванлейбио, Шэньян, Қытай) пайдалана отырып, Western blotting жүргізілді.
Бұрын сипатталған процедурадан кейін [13], жасуша культурасының супернатанттары жиналды және қабынуға қарсы цитокин IL-1β секрециясы тінтуірдің IL-1 Beta ELISA жинағы (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) көмегімен анықталды.IL-1β стандартты қисығын пайдаланып OD450nm мәндерін ақуыз концентрациясына түрлендіріңіз.
Қабықшалармен қапталған жасушалар 3 рет жылы PBS-те ақырын жуылды, тіндік жасушаларды бекітетін құралда (Biosharp, Пекин, Қытай) 10 минут бойы бөлме температурасында (RT), 0,1% Triton X-Permeabilize 100 (PBS сұйылтылған; Biosharp) ) бөлме температурасында 20 минут бойы және бөлме температурасында 2 сағат бойы сиыр сарысуының 5% альбуминінде (ПБС-да) блокталады.Содан кейін жасушалар сәйкесінше ASC (1:100 сұйылту) немесе NLRP3 (1:100 сұйылту) және Cy3 таңбаланған ешкі қоянға қарсы IgG(H+L) (1:400; EarthOx) қарсы бастапқы антиденелермен 4°C температурада түнде инкубацияланды. , Сан-Франциско, CA, АҚШ) немесе FITC конъюгацияланған ешкі тышқанға қарсы IgG (1:400; Earthox) түнде 37°C қараңғы жерде 1 сағат бойы.Ядролар Hoechst 33258 (10 мкг/мл; UE, Сучжоу, Қытай) 5 минут бойы боялған және флуоресцентті микроскоппен (Olympus корпорациясы, Токио, Жапония) бақыланды.
Тышқандар төрт топқа бөлінді (әр топта n = 7): (i) PBS-пен өңделген теріс бақылау тобы (тек PBS; гаваж 100 мкл/тышқан PBS, содан кейін 3 сағаттан кейін күнделікті 100 мкл/тышқан PBS интраперитонеальді инъекция)., үздіксіз 7 күн бойы);(ii) MCC950 ингибиторымен өңделген теріс бақылау тобы [27] (PBS гаваж арқылы 100 мкл/тышқан, 3 сағаттан кейін, 10 мг/кг дене салмағы [BW] MCC950 [PBS ішінде] күн сайын интраперитонеальді енгізілді, ұзақтығы 7 күн);(iii) G. duodenalis кистасының инфекциясы тобы (1,5 x 106 киста/тышқан гаваж арқылы, 3 сағаттан кейін, 100 мкл/тышқан PBS 7 күн бойы күн сайын интраперитонеальді енгізіледі);(iv) G. duodenalis кистасының біріктірілген жұқпалы тобының MCC950 ингибиторын емдеу тобы (1,5×106 киста/тышқанға гаваж арқылы, 10 мг/кг дене салмағы MCC950 күніне 7 күн бойы 3 сағат бойы іш қуысына).Әрбір тышқанның дене салмағы күн сайын бақыланып, барлық тышқандар 7-ші күні эвтанизацияланды.Жиналған ұлтабар (ұзындығы 3 см) 1 мл PBS-де кішкене бөліктерге кесілді, кисталар түнде 4 ° C температурада PBS-де жойылды және G. duodenalis trophozoites.Жаңа он екі елі ішек (ұзындығы 1 см) гематоксилин және эозин (H&E) бояуы үшін бөлініп алынды.
Тышқандар екі топқа бөлінді: (i) MOCK бақылау тобы және (ii) MCC950 тежегіш тобы.Әрбір топта бес емдеу болды (n = 7/емдеу тобы): (i) PBS емдеу теріс бақылау тобы (тек PBS; 100 мкл/тышқан PBS, бұлшықет ішіне (IM) инъекция (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) плазмидті теріс бақылау тобы (100 мкг/тышқан ДНҚ, бұлшықет ішіне енгізу арқылы (iii) G. duodenalis кистасының инфекциясы оң бақылау тобы (1,5 x 106 киста/тышқан, гаваж арқылы) (iv) a pcDNA3.1(+)-альфа-2 плазмидімен өңделген топ (100 мкг/тышқан ДНҚ, бұлшықет ішіне енгізу арқылы) және (v) pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 (100 мкг/тышқан) плазмидасымен өңделген топ ДНҚ, 12 сағат өткеннен кейін MCC950 ингибиторы тобындағы тышқандар 7 күн бойы MCC950 (дене салмағы 10 мг/кг) күнделікті құрсақішілік инъекциясын алды, ал MOCK тобындағы тышқандар PBS өңдеуінің бірдей көлемін алды. Қан үлгілері алынды. тышқандардың көз алмаларынан жиналып, түнде 4 °C температурада қалдырылған сарысу үлгілері IL-1β деңгейлерін анықтау үшін ферментпен байланысты иммуносорбентті талдау (ИФА) арқылы бөлініп алынды.
Отыз бес тышқан бес топқа бөлінді (n=7/топ).1-топ PBS қабылдаған теріс бақылау тобы болды: тышқандар бұлшықет ішіне 100 мкл PBS және 3 күннен кейін гаваж арқылы қабылдады.2-топ G. duodenalis кисталарымен жұқтырған оң бақылау тобы: тышқандарға 100 мкл PBS енгізілді, ал 3 күннен кейін 1,5 x 106 киста/тышқанға асқазан ішіне енгізілді.Үшінші топ – он екі елі ішектің кистасының инфекциясы үшін бақылау тобымен біріктірілген pcDNA3.1(+) көмегімен плазмидті иммундау: тышқандар 100 мкг плазмидтік ДНҚ pcDNA3.1(+)(im) ауызша, 1,5×106 киста/тышқан 3 бірнешеу үшін алды. күндер.4 және 5 топтар G. duodenalis кистасының инфекциясымен біріктірілген рекомбинантты pcDNA3.1(+)-альфа-2 лямин плазмиді немесе pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 лямин плазмиді болды.Эксперименттік топ: тышқандар 100 мкг pcDNA3 алды.1(+)-гиардин плазмидті ДНҚ (im), содан кейін 3 күннен кейін 1,5 × 106 киста/тышқан гаваж арқылы енгізілді.Түтік арқылы G. duodenalis кистасын енгізгеннен кейін әрбір тышқанның дене салмағы бақыланды.Паразиттік жүктемені өлшеу және HE бояуын талдау үшін жаңа он екі елі ішек жиналды.
Гистопатологиялық өзгерістер бұрын жарияланған процедураға сәйкес талданды [30].Жаңа он екі елі ішек тіндік жасушаларды бекітетін затпен бекітіліп, парафинге салынып, 4 мкм кесінділерге кесіліп, H&E бояуымен боялған және жарық микроскопында талданған.Жеті тәуелсіз тышқанның жеті тіндік бөлімдеріндегі репрезентативті патологиялық өзгерістерді емдеуді білмейтін патолог дәрігер бағалады және 200 есе үлкейту кезінде түсірілді.Бүршіктердің ұзындығы мен крипттердің тереңдігі бұрын сипатталған әдістерге сәйкес өлшенді.
Нәтижелер in vitro және in vivo үш данада алынды.Графиктер GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, АҚШ) көмегімен жасалды.Екі топ арасындағы айырмашылықтар t-тестімен, ал ≥3 топтар арасындағы айырмашылықтар SPSS бағдарламалық жасақтамасын (22.0 нұсқасы; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, АҚШ) пайдалану арқылы бір жақты дисперсияны талдау (ANOVA) арқылы талданды.Деректер дисперсияның біртектілігіне Левен сынағы, содан кейін Бонферронидің пост hoc сынағы (B) арқылы талданды.Маңыздылық P<0,05, P<0,01 және P<0,001 (маңызды емес [ns]) (P>0,05) түрінде көрсетіледі.
Киото энциклопедиясындағы гендер мен геномдар энциклопедиясындағы (KEGG) GEV протеомикасына біздің алдыңғы талдауымыз қабыну сигнал беру жолдарын белсендіруге көптеген нысандар қатысуы мүмкін екенін көрсетті [13].Біз екі перспективті нысананы, альфа-2 және альфа-7,3 лямблиндерін таңдадық, осы молекулаларды күшейтіп, оларды pcDNA3.1(+) эукариоттық экспрессия векторын құру үшін қолданамыз.Секвенирлеуден кейін рекомбинантты pcDNA3.1(+)-альфа-2 және альфа-7.3 ляминді экспрессия плазмидалары тінтуірдің бастапқы перитонеальді макрофагтарына трансфекцияланды және қабынудың каспаза-1 p20 белгісі (белсендірілген каспаза-1 фрагменті) анықталды. қабынуды тудыруы мүмкін негізгі молекулаларды түсіндіру ретінде.Нәтижелер альфа-2 және альфа-7,3 лямбриндері GEV-ге ұқсас p20 каспаза-1 экспрессиясын индукциялай алатынын көрсетті.Өңделмеген теріс бақылауда (тек PBS) және pcDNA3.1(+) плазмидтік бақылауда каспаза-1 белсендіруіне ешқандай әсер табылмады (1-сурет).
pcDNA3.1(+)-альфа-2 және альфа-7.3 лямбидтері арқылы p20 каспаза-1 активациясын өлшеу.Рекомбинантты эукариоттық экспрессиялық плазмидалар pcDNA3.1(+)-альфа-2 және альфа-7.3 лямбидтері (әр жолақ үстінде) тінтуірдің бастапқы перитонеальді макрофагтарына трансфекцияланды және культура үстемелері 24 сағаттан кейін жиналды.Вестерн-блотинг каспаза-1 p20 қабынулық протеиннің экспрессия деңгейін өлшеу үшін қолданылды.Теріс бақылау ретінде тек PBS емдеу тобы (C жолағы) және pcDNA3.1(+) монотерапия тобы (pcDNA3.1 жолағы) пайдаланылды, ал GEV емдеу тобы оң бақылау ретінде пайдаланылды.Рекомбинантты ақуыздың экспрессиясы әрбір ақуыздағы гистидин тегін анықтау арқылы расталды және күтілетін белок жолақтары альфа-2 ляардин (38,2 кДа) және альфа-7,3 ямардин (37,2 кДа) болды.GEV, Giardia duodenum жасушадан тыс көпіршіктер, pcDNA3.1(+), EcoRV-сызықты вектор, SUP, супернатант
Альфа-2 гиардин және альфа-7.3 ляардин p20 каспаза-1 экспрессиясын индукциялайтынын және қожайынның NLRP3 қабыну реакциясын белсендіруде рөл атқаратынын анықтау үшін, pcDNA3.1(+)-альфа-2 гиардин және pcDNA3.1(+)-альфа -7.3 гиардин рекомбинантты плазмидті ДНҚ бар тінтуірдің бастапқы перитонеальді макрофагтарына трансфекцияланды және NLRP3 негізгі қабыну ақуыздарының экспрессия, локализация және олигомеризация деңгейлері анықталды.Бұл экспериментте GEV оң бақылау тобы ретінде пайдаланылды, ал емделмеген топ (тек PBS) немесе pcDNA3.1(+) трансфекциямен емдеу тобы теріс топ болды.Нәтижелер GEV тобындағы сияқты лямбина pcDNA3.1(+)-альфа-2 және лямбина pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 рекомбинантты плазмидті ДНҚ NLRP3, pro-IL-1β және жоғары реттеуге әкелетінін көрсетті. прокаспаза-1 және каспаза-1 активтенуі (2а-сурет).Сонымен қатар, екі лямбли де маңызды IL-1β секрециясын индукциялады (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; альфа-2 лямин: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,00 ).;альфа-7,3 лямдин: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, Р<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (2б-сурет).ASC ақуыздарының көпшілігі өңделмеген топта немесе pcDNA3.1(+)-альфа-2 немесе pcDNA3.1(+)-альфа-ға қарағанда, pcDNA3.1(+) плазмидасымен трансфекцияланған емдеу тобында мономерлі болды. 7.3 лямдин.ASC олигомеризациясы GEV оң бақылау тобының немесе тобының рекомбинантты плазмидті ДНҚ-да болды, олигомерлі пішінді көрсетеді (2c-сурет).Бұл алдын ала деректер альфа-2 гиардин мен альфа-7,3 лямбидінің NLRP3 қабынуының белсендіруін тудыруы мүмкін екенін көрсетеді.ASC және NLRP3 локализациясының кейінгі иммунофлуоресцентті зерттеулері теріс бақылау тобында ASC протеині цитоплазмада шашыраңқы болғанын және pcDNA3.1(+)-альфа-2 ляминмен немесе pcDNA3-мен ынталандырылған кезде нүктелік сигнал ретінде пайда болғанын көрсетті.1(+)-альфа-7,3 лямдин тобы немесе GEV оң бақылау тобы (2d-сурет).Теріс бақылау және плазмидамен өңделген pcDNA 3.1 топтарында NLRP3 ақуыз сигналы анықталмады, бұл кезде флуоресцентті сигнал pcDNA3.1(+)-альфа-2 ляардинге немесе pcDNA3.1(+)-альфа-7.3-ке жауап ретінде белгіленді. анықталды..лямдин цитоплазмада немесе HEV стимуляциясында кездеседі (2е-сурет).Бұл деректер одан әрі G. duodenalis giardin alpha-2 және giardin alpha-7.3 тінтуірдің бастапқы перитонеальді макрофагтарында NLRP3 қабынуын белсендіретінін көрсетеді.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin және pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin тінтуірдің перитонеальді макрофагтарындағы NLRP3 қабынуын белсендіреді.Рекомбинантты эукариоттық экспрессия плазмидаларын pcDNA3.1(+)-альфа-2 ляардин және pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 ляардинді біріншілік тышқанның перитонеальді макрофагтары мен жасушаларына трансфекциялаңыз немесе экспрессияны, олигомеризацияны талдау үшін үстіңгі затты 24 сағат ішінде жинаңыз. , секреция.және негізгі қабыну ақуыздарын локализациялау.Теріс бақылау ретінде тек PBS (C) тобы және pcDNA3.1 (+) жалғыз өңдеу тобы, оң топ ретінде GEV емдеу тобы пайдаланылды.a NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 және p20 caspase-1 қоса, негізгі қабыну ақуыздары NLRP3 Western blotting арқылы анықталды.b Супернатанттардағы IL-1β секрециясының деңгейлері ферментпен байланысты иммуносорбенттік талдау (ИФА) көмегімен анықталды.Бақылау және эксперименттік топтар арасындағы айырмашылықтар SPSS бағдарламалық құралының 22.0 нұсқасын пайдаланып бір жақты дисперсияны талдау (ANOVA) арқылы талданды.Жұлдызшалар **P<0,01 және ***P<0,001 топтары арасындағы елеулі айырмашылықтарды көрсетеді.c түйіршіктердегі ASC олигомеризация деңгейлері DSS кросс-байланыстыру талдауымен анықталды, ал жасуша лизаттарындағы ASC деңгейлері жүктеуді бақылау ретінде пайдаланылды.d Иммунофлуоресценция көмегімен ISC локализациясын визуализациялау.e Иммунофлуоресценция NLRP3 локализациясын визуализациялау үшін пайдаланылды.ASC, апоптотикалық дақ тәрізді ақуыз;ИЛ, интерлейкин;NLRP3, нуклеотидті байланыстыратын олигомеризация тәрізді рецептор 3;ns, маңызды емес (P > 0,05)
G. duodenalis және ол бөлетін GEVs NLRP3 қабынуын белсендіреді және in vitro қожайынының қабыну реакцияларын реттейді.Осылайша, G. duodenalis патогенділігіндегі NLRP3 қабынуының рөлі анық емес.Бұл мәселені зерттеу үшін біз G. duodenalis кистасын жұқтырған тышқандар мен G. duodenalis кистасымен + MCC950 ингибиторымен емдеуді жұқтырған тышқандар арасында эксперимент құрастырдық және G. duodenalis кистасын жұқтырған кезде NLRP3 қабыну экспрессиясын салыстырдық.Эксперименттің егжей-тегжейлі схемасы 3а-суретте көрсетілген.Әртүрлі емдеу топтарындағы тышқандардың дене салмағының өзгеруі кисталармен инфекциядан кейін 7 күн бойы бақыланды және нәтижелер 3б-суретте көрсетілген.Таза PBS-пен өңделген топпен салыстырғанда, нәтижелер (i) G. duodenalis кистасын жұқтырған тышқандардың дене салмағының инфекциядан кейінгі 3 күннен 7 күнге дейін төмендегенін көрсетті;(ii) MCC950 тежегішімен емдеу тышқандардың дене салмағына айтарлықтай әсер еткен жоқ..Бір жұқпалы топпен салыстырғанда, MCC950-мен емделген он екі елі ішек инфекциясы тобының BW әртүрлі дәрежеге дейін төмендеді (1-ші күн: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2-ші күн: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001 3-күн: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 5-күн: A (3, 24)=0,6497, P=0,0645; 6-күн: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; 7-күн: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Бұл деректер NLRP3 қабынуы тышқандарды он екі елі ішек инфекциясының ерте кезеңдерінде (2-4 күн) айтарлықтай салмақ жоғалтудан қорғайтынын көрсетеді.Содан кейін біз он екі елі ішекті шаю сұйықтығында G. duodenalis trophozoites анықтауды мақсат еттік және нәтижелер 3c суретте көрсетілген.G. duodenalis кистасының инфекциясы тобымен салыстырғанда, NLRP3 қабынуын блоктағаннан кейін он екі елі ішектегі трофозоиттер саны айтарлықтай өсті (t(12) = 2,902, P = 0,0133).HE-мен боялған ұлтабар тіндері тек PBS және MCC950-мен өңделген теріс бақылаумен салыстырғанда: (i) G. duodenalis кистасының инфекциясы он екі елі ішектің бүршіктерінің зақымдалуына әкелді (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488). ) және крипт атрофиясы (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis кисталарын жұқтырған және MCC950 тежегіштерімен емделген тышқандардың он екі елі ішек.он екі елі ішектің бүршіктері зақымданған және өлі (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) атрофиясы және крипттің тармақталуымен (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (3d- сурет) f) .Бұл нәтижелер NLRP3 қабынуының G. duodenalis патогенділігін төмендетуде рөл атқаратынын көрсетеді.
Giardia он екі елі ішек инфекциясындағы NLRP3 қабынуының рөлі.Тышқандар (iv) дуоденококк кисталарымен ашылды, содан кейін MCC950 (ip) бар немесе онсыз емделді.PBS немесе MCC950 бар жалғыз өңдеу топтары бақылау ретінде пайдаланылды.Эксперименттік топ және емдеу режимі.b Әр түрлі емдеу топтарындағы тышқандардың дене салмағы 7 күн бойы бақыланды.G. duodenalis инфекциясы тобы мен G. duodenalis + MCC950 инфекциясын емдеу тобы арасындағы айырмашылық SPSS бағдарламалық жасақтамасының 22.0 нұсқасын пайдаланып t-тест арқылы талданды.Жұлдызшалар *P<0,05, **P<0,01 немесе ***P<0,001 мәндеріндегі елеулі айырмашылықтарды көрсетеді.c Паразиттік жүктеме он екі елі ішекті шаю сұйықтығындағы трофозоиттер санын санау арқылы анықталды.G. duodenalis инфекциясы тобы мен G. duodenalis + MCC950 инфекциясын емдеу тобы арасындағы айырмашылық SPSS бағдарламалық жасақтамасының 22.0 нұсқасын пайдаланып t-тест арқылы талданды.Жұлдызшалар *P <0,05 мәніндегі елеулі айырмашылықтарды көрсетеді.d Он екі елі ішектің гистопатологиясының гематоксилин және эозин (H&E) бояу нәтижелері.Қызыл көрсеткілер вилланың зақымдалуын көрсетеді, жасыл көрсеткілер крипттердің зақымдалуын көрсетеді.Масштаб жолағы: 100 мкм.e, f Он екі елі ішек виллусының биіктігі мен тінтуір криптінің биіктігін статистикалық талдау.Жұлдызшалар *P<0,05 және **P<0,01 мәндеріндегі елеулі айырмашылықтарды көрсетеді.Нәтижелер 7 тәуелсіз биологиялық тәжірибеден алынған.BW, дене салмағы;ig, асқазанішілік жеткізу жолы;ip, құрсақішілік жеткізу жолы;ns, маңызды емес (P > 0,05);PBS, фосфатты буферлік тұзды ерітінді;WT, жабайы түрі
IL-1β секрециясы қабынудың белсендіруінің белгісі болып табылады.G. duodenalis альфа-2 гиардин және альфа-7.3 гиардин in vivo NLRP3 хостының қабынуын белсендіретінін анықтау үшін біз өңделмеген WT тышқандарын (жалған топ) және NLRP3 қабынуы бұғатталған тышқандарды (MCC950 тежейтін емдеу тобы) қолдандық.Эксперименттің егжей-тегжейлі схемасы 4а-суретте көрсетілген.Эксперименттік топтар PBS, G. duodenalis кистасын гаваж әдісімен емдеу, pcDNA3.1 бұлшықет ішіне енгізу және pcDNA3.1(+)-alpha-2 лямбдин немесе pcDNA3.1-alpha-7.3 гиардинді бұлшықет ішіне енгізу арқылы өңделген тышқандардан тұрды.Рекомбинантты плазмиданы бұлшықет ішіне енгізгеннен кейін 7-ші күні қан сарысуы жиналып, әр топтағы IL-1β деңгейі анықталды.4b-суретте көрсетілгендей, MOCK тобында: (i) PBS тобымен салыстырғанда, pcDNA3.1 өңдеуі IL-1β секрециясына айтарлықтай әсер еткен жоқ (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), алайда, IL-β секрециясы G. duodenalis кистасы тобындағы (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 лямин және pcDNA3 тобында айтарлықтай жоғарылады.1- Альфа-7,3 ляминді бұлшықет ішіне енгізу қан сарысуындағы IL-1β деңгейін айтарлықтай арттырды (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 лямин индукцияланған IL-1β секрециясының жоғары деңгейі pcDNA3.1-alpha-2 ляминді бұлшықет ішіне енгізу тобында (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.033) .MCC950 емдеу тобындағы және MOCK тобындағы әрбір топпен салыстырғанда: (i) PBS бақылау тобындағы және pcDNA3.1 бақылау тобындағы IL-1β секрециясының деңгейлері MCC950 тежегішін блоктағаннан кейін белгілі бір дәрежеде төмендеді, бірақ айырмашылық онша емес еді. маңызды (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) MCC950 блоктағаннан кейін., IL-1β секрециясы G. duodenalis кистасымен жұқтырған топта, pcDNA3.1-alpha-2 лямин тобында және pcDNA3.1-alpha-7.3 лямдин тобында (G. duodenalis: ANOVA, F(9) айтарлықтай төмендеді. , 58) = 3,540 , P = 0,0120 pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7,3 лямбдин: ANO8; ) = 3,540, P = 0,0164).Бұл нәтижелер альфа-2 гиардин мен альфа-7,3 ляминнің in vivo NLRP3 қабынуының белсендірілуіне делдал болатынын көрсетеді.
pcDNA3.1(+)-лямбардиндер in vivo NLRP3 хост қабынуын белсендіреді.Тышқандар рекомбинантты эукариоттық экспрессиялы плазмид pcDNA3.1(+)-альфа-2 ляардин немесе pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 ляардинмен иммунизацияланды (IM), содан кейін MCC950 (ip; MCC950 тобы) немесе жоқ (жалған топ) емделді. ).Теріс бақылау ретінде PBS немесе pcDNA3.1(+) плазмидті емдеу тобы, оң бақылау ретінде G. duodenalis кистасын емдеу тобы пайдаланылды.Эксперименттік топ және емдеу режимі.b Тышқандардағы IL-1β сарысу деңгейі 7-ші күні ELISA талдауымен өлшенді.MOCK тобындағы топтар арасындағы айырмашылықтар бір жақты ANOVA көмегімен талданды, ал MOCK тобы мен MCC950 тобы арасындағы айырмашылықтар SPSS бағдарламалық жасақтамасының 22.0 нұсқасының t-тесті арқылы талданды.Жұлдызшалар MOCK тобындағы емдеу топтары арасындағы елеулі айырмашылықтарды көрсетеді, *P<0,05 және ***P<0,001;доллар белгілері ($) P<0,05 деңгейінде MOCK тобы мен MCC950 тобындағы әр топ арасындағы айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді.Жеті тәуелсіз биологиялық тәжірибенің нәтижелері.i, бұлшықет ішіне енгізу, ns, маңызды емес (P > 0,05)
G. duodenalis жұқпалылығына NLRP3 хост қабынуының альфа-2 және альфа-7.3 гиардин арқылы белсендірілуін зерттеу үшін біз WT C57BL/6 тышқандарын қолданып, альфа-2 гиардин мен альфа-7.3 ляминді енгіздік.плазмидті бұлшықет ішіне, 3 күннен кейін G. duodenalis кистасының асқазан түтігі арқылы енгізді, содан кейін тышқандар 7 күн бойы бақыланды.Эксперименттің егжей-тегжейлі схемасы 5а-суретте көрсетілген.Әрбір тышқанның дене салмағы күн сайын өлшенді, асқазан түтігі арқылы енгізгеннен кейін 7-ші күні жаңа он екі елі ішек тінінің үлгілері алынды, трофозоиттер саны өлшенді, гистопатологиялық өзгерістер байқалды.5b-суретте көрсетілгендей, азықтандыру уақытының ұлғаюымен әрбір топтағы тышқандардың BW бірте-бірте өсті.Тышқандардың МТ G.duodenalis кистасын асқазанға енгізгеннен кейін 3-ші күні төмендей бастады, содан кейін біртіндеп жоғарылады.Альфа-2 гиардин мен альфа7.3 ляминді бұлшықет ішіне енгізу арқылы индукцияланған NLRP3 қабынуының белсендірілуі тышқандардағы салмақ жоғалтуды айтарлықтай әлсіретеді (1-ші күн: pcDNA3.1-alpha-2 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 1. = 0 .9754 1-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 2-күн: pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 2-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямблин, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 3-күн: pcDNA3.1-alpha-2NOVA, 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3-ші күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 4-күн: pcDNA3.1-VA.Ga-; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, 5-күн: pcDNA3.1-alpha 2 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5-күн: pcDNA3.1-альфа -7.3 лямбина, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 3-күн: pc -D альфа-2 ямардина, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6-күн: pcDNA3.1-альфа-7.3 лямдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;7-күн: pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 7-күн: pcDNA3.1-alpha-7.3 лямбдин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, <0,0001).Он екі елі ішекте паразиттік жүктеме бағаланды (5в-сурет).Өңделмеген оң бақылаумен және бос pcDNA3.1 векторымен енгізілген топпен салыстырғанда, G. duodenalis трофозоиттерінің саны α-2 ляардин және α-7,3 лямдин (pcDNA3.1-альфа) енгізілген топтарда айтарлықтай төмендеді. -2 лямбдин : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-альфа-7,3 лямдин: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Сонымен қатар, лямбиль альфа-7,3 тышқандарда лямбиль альфа-2-ге қарағанда көбірек қорғаныш болды (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).HE бояуының нәтижелері күріште көрсетілген.5d–f.Альфа-2 гиардин және альфа-7,3 гиардин инъекциясы енгізілген тышқандарда G. duodenalis инъекциясы енгізілген тышқандармен және бос pcDNA3 векторымен біріктірілген G. duodenalis инъекциясымен тышқандармен салыстырғанда виллус зақымдануымен көрінетін ұлтабар тінінің зақымдануы азырақ болды.(pcDNA3.1-alpha-2 лямбдин: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 немесе P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 лямин: ANOVA, F(3, 24) = 2.46 = 0,0028 немесе P = 0,0055) және төмендеген крипт атрофиясы (pcDNA3.1-альфа-2 лямин: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 немесе P = 0.0158; pcDNA3.1-alphaine: A3VA- , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 немесе P = 0,0191).Бұл нәтижелер альфа-2 гиардин және альфа-7,3 гиардин in vivo NLRP3 қабынуын белсендіру арқылы G. duodenalis жұқпалылығын төмендететінін көрсетеді.
G. duodenalis инфекциясындағы pcDNA3.1(+)-гиардиндердің рөлі.Тышқандар рекомбинантты эукариоттық экспрессиялық плазмидалар pcDNA3.1(+)-альфа-2 ляардин немесе pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 ляардинмен иммунизацияланды (IM), содан кейін G. duodenalis кисталарымен (ig) шақырылды.PBS тобы және pcDNA3.1(+) + ұлтабар кистасын емдеу тобы теріс бақылау тобы ретінде, ал он екі елі ішек кистасын емдеу тобы оң бақылау тобы ретінде пайдаланылды.Эксперименттік топ және емдеу режимі.b Әр түрлі емдеу топтарының әрқайсысындағы тышқандардың MT сынақтан кейінгі 7 күн бойы бақыланды.Жұлдызшалар G. duodenalis тобындағы және pcDNA3.1(+)-альфа-2 лямдин тобындағы топтар арасындағы елеулі айырмашылықтарды көрсетеді, *P <0,05, **P <0,01 және ***P <0,001;доллар белгісі ($) G. duodenalis әр тобы мен pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 жардин тобы, $$P<0.01 және $$$P<0.001 арасындағы айтарлықтай айырмашылықты көрсетеді.c Паразиттік жүктеме он екі елі ішектен 1 мл он екі елі ішекті шаюда (ұзындығы 3 см) трофозоиттер санын санау арқылы анықталды және он екі елі ішектің бір см паразиттерінің санымен өрнектелді.G. duodenalis инфекциясы тобы, pcDNA3.1(+)-альфа-2 лямбид тобы және pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 лямбид тобы арасындағы айырмашылықтар SPSS бағдарламалық құралының 22.0 нұсқасын пайдаланып бір жақты ANOVA әдісімен талданған.Жұлдызшалар **P<0,01 және ***P<0,001 мәндеріндегі елеулі айырмашылықтарды көрсетеді.d Он екі елі ішектегі гистологиялық өзгерістер.Қызыл көрсеткілер вилланың зақымдалуын көрсетеді, жасыл көрсеткілер крипттердің зақымдалуын көрсетеді.Масштаб жолағы: 100 мкм.e, f Тышқанның ұлтабар виллусының биіктігін (e) және крипт биіктігін (f) статистикалық талдау.1d-суреттегі топтар арасындағы айырмашылықтар SPSS бағдарламалық жасақтамасының 22.0 нұсқасын пайдаланып бір жақты ANOVA әдісімен талданды.Жұлдызшалар *P<0,05 және **P<0,01 мәндеріндегі елеулі айырмашылықтарды көрсетеді.Жеті тәуелсіз биологиялық тәжірибенің нәтижелері.ns, маңызды емес (P > 0,05)
Giardia duodenum — лямблиозды тудыратын адамдар мен басқа сүтқоректілердің белгілі ішек паразиті.2004 жылы ол 6 жыл ішінде, әсіресе әлеуметтік-экономикалық жағдайы төмен қауымдастықтарда таралуының жоғары болуына байланысты Дүниежүзілік денсаулық сақтау ұйымының назардан тыс қалған аурулар бастамасына енгізілді [32].Туа біткен иммундық жүйе G. duodenalis инфекциясына иммундық жауапта шешуші рөл атқарады.Тышқан макрофагтары G. duodenalis-ті жұтып, жасушадан тыс тұзақтарды шығару арқылы өлтіретіні туралы хабарланған [33].Біздің алдыңғы зерттеулеріміз G. duodenalis, инвазивті емес жасушадан тыс паразиттің тінтуір макрофагтарындағы p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 және NLRP3 қабыну сигнал беру жолдарын белсендіретінін және хосттың қабыну реакциясын реттеуге мүмкіндік беретінін көрсетті және босатылған GEV бұл процесті күшейтуі мүмкін.13], 24].Дегенмен, GEV-дегі NLRP3 қабынуымен реттелетін қабынуға қатысатын нақты PAMP-тер және лямблиоздағы NLRP3 қабынуының рөлі әлі де анықталуы керек.Осы екі сұрақты түсіндіру үшін біз осы зерттеуді жүргіздік.
NLRP3 қабынуы иммундық жасушалардың цитоплазмасында орналасқан және несеп қышқылы кристалдары, токсиндер, бактериялар, вирустар және паразиттер сияқты әртүрлі бөлшектермен белсендірілуі мүмкін.Бактериялық зерттеулерде токсиндер қабыну сенсорларын белсендіретін, қабынуға және жасуша өліміне әкелетін негізгі ПАМП ретінде анықталды [34].Кейбір құрылымдық әртүрлі токсиндер, мысалы, алтын стафилококк [35] және ішек таяқшасы [36] гемолизині, энтеротоксиннен (NHE) [37] гемолизин BL (HBL) [37], NLRP3 қабынуының белсендіруін тудырады.Вирустық зерттеулер SARS-COV-2 конверті (E) протеині [38] және Zika вирусы NS5 протеині [39] сияқты вирулентті ақуыздардың NLRP3 рецепторы таныған маңызды PAMP болып табылатынын көрсетті.Паразиттік зерттеулерде көптеген паразиттердің Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] және лейшмания [42] сияқты қожайын қабынуының активтенуімен байланысты екені хабарланды.Toxoplasma gondii вируленттілігімен байланысты тығыз түйіршік ақуыздары GRA35, GRA42 және GRA43 Льюис егеуқұйрық макрофагтарында пироптозды индукциялау үшін қажет [43].Сонымен қатар, кейбір лейшмания зерттеулері NLRP3 қабынуына қатысатын жеке молекулаларға, мысалы, паразиттік мембраналық липофосфогликан [44] немесе мырыш металлопротеазасы [45] назар аударды.Анексин тәрізді альфа-гиардин гендерінің отбасының ішінде альфа-1 лямбина тінтуір үлгісінде G. duodenalis-тен қорғауды қамтамасыз ететін әлеуетті вакцина үміткері екендігі көрсетілді [18].Біздің зерттеуімізде біз G. duodenalis вируленттік факторлары альфа-2 және альфа-7,3 лямблияға тән, бірақ салыстырмалы түрде азырақ хабарланған лямблияларды таңдадық.Бұл екі мақсатты ген қабыну белсендіруін талдау үшін pcDNA3.1(+) эукариоттық экспрессия жүйесінің векторына клондалған.
Біздің тінтуір үлгісінде кесілген каспас фрагменттері қабынуды белсендіру маркерлері ретінде қызмет етеді.Қоздырудан кейін NLRP3 ASC-пен әрекеттеседі, прокаспазаларды жинайды және pro-IL-1β және pro-IL-18-ді тиісінше -18 жетілген IL-1β және IL-18-ге бөлетін белсенді каспазаларды жасайды.Қабыну каспаздары (каспазалар-1, -4, -5 және -11) туа біткен қорғаныс үшін маңызды және қабынуға және бағдарламаланған жасуша өліміне қатысатын цистеин протеазаларының сақталған отбасы болып табылады [46].Каспаза-1 канондық қабынулар арқылы белсендіріледі [47], ал каспазалар-4, -5 және -11 атиптік қабынулар түзілу кезінде бөлінеді [48].Бұл зерттеуде біз модель ретінде тінтуірдің перитонеальді макрофагтарын қолдандық және G. duodenalis инфекциясын зерттеуде қожайын NLRP3 қабынуының белсендіруінің маркері ретінде p20 каспас-1 жарылған каспаза-1 зерттелді.Нәтижелер көптеген альфа-гиардиндер қабынудың типтік активтенуіне жауапты екенін көрсетті, бұл бактериялар мен вирустарға қатысатын негізгі вирулентті молекулалардың ашылуына сәйкес келеді.Дегенмен, біздің зерттеуіміз тек алдын ала экран болып табылады және классикалық емес қабынуларды белсендіре алатын басқа молекулалар бар, өйткені біздің алдыңғы зерттеуіміз G. duodenalis инфекциясында классикалық және классикалық емес қабынуларды анықтады [13].Түзілген p20 каспазасы-1 NLRP3 қабынуымен байланысты ма, жоқ па, соны анықтау үшін біз альфа-2 және альфа-7.3 ляминдерді тінтуірдің перитонеальді макрофагтарына трансфекциялап, негізгі молекула ақуызының экспрессия деңгейлерін және ASC олигомеризация деңгейлерін анықтау үшін α-лямбаздың екеуінің де белсендіретінін растадық. қабыну NLRP3.Біздің нәтижелеріміз G. muris немесе E. coli EPEC штаммдарымен Caco-2 жасушаларын ынталандыру NLRP3, ASC және каспаза-1 флуоресценция қарқындылығын арттыруы мүмкін екенін хабарлаған Manko-Prykhoda және басқаларының нәтижелерінен сәл ерекшеленеді. айтарлықтай болмаса да, G. muris және E. coli костимуляциясы үш ақуыздың деңгейін қалай арттырды [49].Бұл сәйкессіздік Giardia түрлерінің, жасуша линияларының және бастапқы жасушалардың таңдауындағы айырмашылықтарға байланысты болуы мүмкін.Біз сондай-ақ G. duodenalis-ке сезімтал 5 апталық WT C57BL/6 тышқандарында MCC950 көмегімен in vivo талдауларын жасадық.MCC950 - күшті және селективті шағын молекулалы NLRP3 ингибиторы, ол наномольдік концентрацияларда канондық және канондық емес NLRP3 белсендіруін блоктайды.MCC950 NLRP3 белсендіруін тежейді, бірақ AIM2, NLRC4 және NLRP1 қабыну жолдарының немесе TLR сигнал беру жолдарының белсендірілуіне әсер етпейді [27].MCC950 NLRP3 белсендіруін блоктайды, бірақ NLRP3 инициациясын, K+ ағынын, Ca2+ ағынын немесе NLRP3 және ASC арасындағы әрекеттесуді тежемейді;оның орнына ол ASC олигомеризациясын блоктау арқылы NLRP3 қабынуының активтенуін тежейді [27].Сондықтан біз лямбольді инъекциядан кейін NLRP3 қабынуының рөлін анықтау үшін in vivo зерттеуде MCC950 қолдандық.Белсендірілген каспаза-1 p10 қабынуға қарсы цитокиндерді pro-IL-1β және pro-IL-18-ді жетілген IL-1β және IL-18 [50] етіп бөледі.Бұл зерттеуде MCC950 бар немесе онсыз лямбидпен өңделген тышқандардағы сарысудағы IL-1β деңгейлері NLRP3 қабынуының белсендірілгендігінің көрсеткіші ретінде пайдаланылды.Күтілгендей, MCC950 емі сарысудағы IL-1β деңгейін айтарлықтай төмендетті.Бұл деректер G. duodenalis giardin alfa-2 және giardin alfa-7.3 NLRP3 тінтуірінің қабынуын белсендіруге қабілетті екенін анық көрсетеді.
Соңғы онжылдықта жинақталған маңызды деректер IL-17A G. muris-ке қарсы иммунитеттің негізгі реттеушісі, IL-17RA сигналын индукциялайтын, антимикробтық пептидтерді өндіретін және комплемент активациясын реттейтінін көрсетті [51].Дегенмен, лямблия инфекциясы жас ересектерде жиі кездеседі және жас тышқандардағы лямблия инфекциясы оның қорғаныс әсерін көрсету үшін IL-17A реакциясын белсендірмейтіні хабарланды [52], бұл зерттеушілерді басқа иммуномодуляциялық лямблияны іздеуге итермелейді.гельминт инфекциясының механизмдері.Жақында жүргізілген зерттеудің авторлары G. muris E. coli EPEC арқылы NLRP3 қабынуын белсендіре алатынын хабарлады, бұл микробқа қарсы пептидтердің өндірісіне ықпал етеді және оның қосылу қабілетін және ішек жолындағы трофозоиттер санын азайтады, осылайша тоқ ішектің ауырлығын төмендетеді. таяқшалар тудыратын аурулар [49 ].NLRP3 қабынуы әртүрлі аурулардың дамуына қатысады.Зерттеулер көрсеткендей, Pseudomonas aeruginosa жасуша өлімін болдырмау үшін макрофагтарда аутофагияны тудырады және бұл процесс NLRP3 қабынуының белсендірілуіне байланысты [53].N. caninum үшін NLRP3 қабынуының реактивті оттегі түрлері арқылы белсендірілуі оның иесінде репликациясын шектейді, бұл оны әлеуетті терапиялық мақсатқа айналдырады [9].Paracoccidioides brasiliensis тінтуірдің сүйек кемігінен алынған дендриттік жасушаларда NLRP3 қабынуының белсендірілуін индукциялайтыны анықталды, нәтижесінде иесінің қорғанысында маңызды рөл атқаратын IL-1β қабыну цитокинінің шығарылуына әкеледі [10].Лейшманияның бірнеше түрлері, соның ішінде L. amazonensis, L. major, L. braziliensis және L. infantum chagasi макрофагтардағы NLRP3 және ASC-тәуелді каспаза-1, сондай-ақ лейшмания инфекциясын белсендіреді.NLRP3/ASC/caspase-1 генінде жетіспейтін тышқандарда паразиттердің репликациясы күшейеді [11].Замбони және т.б.Лейшмания инфекциясы жасушаішілік паразиттердің репликациясын шектейтін макрофагтардағы NLRP3 қабынуының активтенуін индукциялайды деп хабарланған.Осылайша, лейшмания аулақ болу стратегиясы ретінде NLRP3 белсендіруін тежей алады.In vivo зерттеулерінде NLRP3 қабынуы лейшманияны жоюға ықпал етті, бірақ тіндерге әсер етпеді [54].Керісінше, гельминтозды зерттеулерде NLRP3 қабынуының активтенуі қожайынның асқазан-ішек гельминтоздарына қарсы қорғаныс иммунитетін басады [12].Шигелла бүкіл әлемде диареяны тудыратын негізгі бактериялардың бірі болып табылады.Бұл бактериялар IL-1β өндірісін P2X7 рецепторлары арқылы жүзеге асырылатын K+ ағыны, реактивті оттегі түрлері, лизосомалық қышқылдандыру және митохондриялық зақымдану арқылы тудыруы мүмкін.NLRP3 қабынуы фагоцитозды және шигеллаға қарсы макрофагтардың бактерицидтік белсенділігін теріс реттейді [55].Плазмодий зерттеулері AIM2, NLRP3 немесе каспаза-1 тапшылығы бар плазмодий жұқтырған тышқандар 1 типті интерферонның жоғары деңгейін өндіретінін және Plasmodium инфекциясына төзімдірек екенін көрсетті [56].Дегенмен, тышқандардағы NLRP3 қабынуының патогенді активтенуін индукциялаудағы альфа-2 лямбидінің және альфа-7.3 ляминнің рөлі түсініксіз.
Бұл зерттеуде NLRP3 қабынуының MCC950 арқылы тежелуі тышқандардағы ішекті шаю сұйықтығында BW деңгейін төмендетті және трофозоиттер санын көбейтті, нәтижесінде он екі елі ішек тінінде ауыр патологиялық өзгерістер болды.Альфа-2 гиардин және альфа-7,3 лямдин қожайын тінтуірінің NLRP3 қабынуын белсендіреді, тышқанның дене салмағын арттырады, ішекті шаю сұйықтығындағы трофозоиттер санын азайтады және ұлтабардың патологиялық зақымдануын жеңілдетеді.Бұл нәтижелер G. duodenalis тышқандардағы G. duodenalis патогенділігін төмендете отырып, альфа-2 гиардин және альфа-7,3 гиардин арқылы NLRP3 хост қабынуын белсендіре алатындығын көрсетеді.
Біздің нәтижелеріміз альфа-2 және альфа-7,3 лямбриндердің NLRP3 иесі қабынуының активтенуін индукциялайтынын және тышқандардағы G. duodenalis инфекциясын төмендететінін көрсетеді.Сондықтан бұл молекулалар лямблиоздың алдын алудың перспективалы мақсаттары болып табылады.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Лян AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Лямблиоз: шолу.Жақында Пэт Қабынудың есірткіге аллергиясы бар екені анықталды.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: фармакотерапияға шолу.Фармацевттің сарапшы пікірі.2007;8: 1885–902.
Тянь Хуафэн, Чен Бин, Вэн Цзянфэн.Лямблиоз, дәріге төзімділік және жаңа мақсаттарды ашу.Дәрілік заттарды жұқтырады.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, т.б. NLRP3 қабыну және қабыну аурулары.Оксидті орта жасуша Longev.2020;2020:4063562.
Чен Ги, Нуньес Г. Ішек қабынуы мен ісік ауруындағы қабынудың рөлі.Гастроэнтерология.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Иммундық төзімділік пен ішек қабынуының тоғысқан жерінде канондық және атиптік NLRP3 қабынуды белсендіру.алдын ала иммундық.2017;8:36.
Ли Л, Ван ХС, Гонг ПТ, Чжан Н, Чжан Х, Ли С және т.б.N. caninum инфекциясына жауап ретінде ROS арқылы NLRP3 қабынуды белсендіру қатысады.Паразиттер векторы.2020;13:449.