Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Өкпенің муковисцидозын емдеуге арналған гендік векторлар өткізгіш тыныс жолдарына бағытталуы керек, өйткені өкпенің шеткергі трансдукциясы емдік әсер етпейді.Вирустық трансдукцияның тиімділігі тасымалдаушының тұру уақытына тікелей байланысты.Дегенмен, гендік тасымалдаушылар сияқты жеткізу сұйықтықтары ингаляция кезінде альвеолаларға табиғи түрде таралады және кез келген пішіндегі емдік бөлшектер мукоцилиарлы тасымалдау арқылы тез жойылады.Тыныс алу жолдарында гендік тасымалдаушылардың тұру уақытын ұзарту маңызды, бірақ оған қол жеткізу қиын.Тыныс алу жолдарының бетіне бағытталуы мүмкін тасымалдаушы-конъюгацияланған магниттік бөлшектер аймақтық мақсаттылықты жақсарта алады.In vivo бейнелеу проблемаларына байланысты, қолданылған магнит өрісі болған кезде тыныс алу жолының бетіндегі осындай кішкентай магниттік бөлшектердің әрекеті нашар түсініледі.Бұл зерттеудің мақсаты бір және көлемді бөлшектердің динамикасы мен мінез-құлқын in vivo зерттеу үшін жансыздандырылған егеуқұйрықтардың трахеясындағы магниттік бөлшектер сериясының қозғалысын in vivo визуализациялау үшін синхротронды бейнелеуді пайдалану болды.Содан кейін біз магниттік өрістің қатысуымен лентивирустық магниттік бөлшектерді жеткізу егеуқұйрық трахеясындағы трансдукцияның тиімділігін арттыра ма, жоқ па деп бағаладық.Синхротронды рентгендік бейнелеу магниттік бөлшектердің стационарлық және қозғалатын магнит өрістеріндегі әрекетін in vitro және in vivo көрсетеді.Бөлшектерді магниттердің көмегімен тірі тыныс жолдарының бетіне оңай сүйреп апаруға болмайды, бірақ тасымалдау кезінде шөгінділер магнит өрісі ең күшті болатын көру аймағында шоғырланады.Лентивирустық магниттік бөлшектер магнит өрісінің қатысуымен жеткізілген кезде трансдукция тиімділігі де алты есе артты.Біріктірілген бұл нәтижелер лентивирустық магниттік бөлшектер мен магнит өрістері in vivo өткізгіш тыныс жолдарындағы ген векторының мақсаттылығы мен трансдукция деңгейлерін жақсарту үшін құнды тәсілдер болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Муковисцидоз (CF) CF трансмембраналық өткізгіштік реттегіші (CFTR) деп аталатын бір гендегі вариациялардан туындайды.CFTR протеині - иондық арна, ол бүкіл денедегі көптеген эпителий жасушаларында, соның ішінде тыныс алу жолдарында, муковисцидоз патогенезіндегі негізгі орын.CFTR ақаулары судың қалыптан тыс тасымалдануына, тыныс жолдарының бетінің сусыздануына және тыныс жолдарының беткі сұйықтық қабатының (ASL) тереңдігінің төмендеуіне әкеледі.Ол сондай-ақ шырышты тасымалдау (MCT) жүйесінің тыныс алу жолдарын деммен жұлатын бөлшектер мен патогендерден тазарту қабілетін нашарлатады.Біздің мақсатымыз - CFTR генінің дұрыс көшірмесін жеткізу және ASL, MCT және өкпе денсаулығын жақсарту үшін лентивирустық (LV) гендік терапияны жасау және осы параметрлерді in vivo1 өлшей алатын жаңа технологияларды әзірлеуді жалғастыру.
LV векторлары муковисцидоз гендік терапиясына жетекші кандидаттардың бірі болып табылады, өйткені олар терапевтік генді тыныс жолдарының базальды жасушаларына (тыныс жолдарының дің жасушалары) тұрақты түрде біріктіре алады.Бұл өте маңызды, өйткені олар муковисцидозбен байланысты функционалды гендік түзетілген тыныс жолдарының беткі жасушаларына дифференциациялану арқылы қалыпты ылғалдану мен шырышты тазартуды қалпына келтіре алады, нәтижесінде өмір бойы пайда болады.LV векторлары өткізгіш тыныс жолдарына қарсы бағытталуы керек, өйткені КФ-да өкпенің тартылуы осы жерден басталады.Вектордың өкпеге тереңірек жеткізілуі альвеолярлы трансдукцияға әкелуі мүмкін, бірақ бұл муковисцидозда емдік әсер етпейді.Дегенмен, гендік тасымалдаушылар сияқты сұйықтықтар босанғаннан кейін дем алған кезде альвеолаларға табиғи түрде ауысады3,4 және емдік бөлшектер MCT арқылы ауыз қуысына тез шығарылады.LV трансдукциясының тиімділігі жасушалық сіңіруге мүмкіндік беру үшін вектордың мақсатты жасушаларға жақын қалу уақытының ұзақтығына тікелей байланысты – «тұру уақыты» 5, ол әдеттегі аймақтық ауа ағынымен оңай қысқартылады, сондай-ақ шырыш пен MCT бөлшектерін үйлестірілген қабылдау.Муковисцидоз үшін тыныс жолдарында LV тұру уақытын ұзарту мүмкіндігі осы аймақта трансдукцияның жоғары деңгейіне жету үшін маңызды, бірақ осы уақытқа дейін қиын болды.
Бұл кедергіні еңсеру үшін біз LV магниттік бөлшектері (МП) бір-бірін толықтыратын екі жолмен көмектесе алатынын ұсынамыз.Біріншіден, олар мақсатты жақсарту және ген тасымалдаушы бөлшектердің тыныс алу жолының дұрыс аймағында болуына көмектесу үшін тыныс алу жолының бетіне магнит арқылы бағытталуы мүмкін;және ASL) жасуша қабатына ауысады 6. МП-лар антиденелермен, химиотерапиялық препараттармен немесе жасуша мембраналарына қосылатын немесе олардың тиісті жасуша бетіндегі рецепторларымен байланысатын және ісік ошақтарында жиналатын басқа шағын молекулалармен байланысқан кезде дәрі-дәрмектің мақсатты тасымалдағыштары ретінде кеңінен қолданылады. статикалық электр тогының болуы.Қатерлі ісіктерді емдеуге арналған магнит өрістері 7. Басқа «гипертермиялық» әдістер тербелмелі магнит өрістерінің әсерінен МП қыздыру арқылы ісік жасушаларын жоюға бағытталған.ДНҚ-ның жасушаларға тасымалдануын күшейту үшін магнит өрісі трансфекция агенті ретінде пайдаланылатын магниттік трансфекция принципі әдетте трансдукциялануы қиын жасуша желілері үшін вирустық емес және вирустық гендік векторлар ауқымын пайдалана отырып in vitro қолданылады. ..Статикалық магнит өрісі болған кезде LV MP in vitro-да адамның бронх эпителийінің жасушалық сызығына жеткізілуімен LV магнитотрансфекциясының тиімділігі белгіленді, бұл тек LV векторымен салыстырғанда трансдукция тиімділігін 186 есе арттырды.LV MT муковисцидоздың in vitro моделіне де қолданылды, мұнда магниттік трансфекция муковисцидозды қақырық болған кезде ауа-сұйықтық интерфейс мәдениеттерінде LV трансдукциясын 20 есе арттырды10.Дегенмен, in vivo органның магнитотрансфекциясы салыстырмалы түрде аз назар аударды және жануарларға арналған бірнеше зерттеулерде ғана бағаланды11,12,13,14,15, әсіресе өкпеде16,17.Дегенмен, муковисцидозда өкпе терапиясында магниттік трансфекцияның мүмкіндіктері анық.Тан және т.б.(2020) «магниттік нанобөлшектерді өкпеге тиімді жеткізу бойынша валидациялық зерттеу муковисцидозы бар науқастарда клиникалық нәтижелерді жақсарту үшін болашақ CFTR ингаляциялық стратегияларына жол ашады» деп мәлімдеді.
Қолданылған магнит өрісі болған кезде тыныс алу жолдарының бетіндегі ұсақ магниттік бөлшектердің әрекетін елестету және зерттеу қиын, сондықтан олар нашар түсініледі.Басқа зерттеулерде біз инвазивті емес бейнелеуге және газ арнасының бетінің ылғалдануын тікелей өлшеуге арналған ASL18 тереңдігі мен MCT19 мінез-құлқындағы минуттық in vivo өзгерістерінің мөлшерін анықтауға арналған синхротрондық таралу негізіндегі фазалық контрастты рентгендік бейнелеу (PB-PCXI) әдісін әзірледік. және емдеу тиімділігінің ерте индикаторы ретінде қолданылады.Сонымен қатар, біздің MCT бағалау әдісімізде PB-PCXI21 арқылы көрінетін MCT маркерлері ретінде алюминий тотығынан немесе жоғары сыну көрсеткіші шыныдан тұратын диаметрі 10-35 мкм бөлшектер қолданылады.Екі әдіс те көптеген бөлшектер түрлерін, соның ішінде МП-ны бейнелеуге жарамды.
Жоғары кеңістіктік және уақыттық ажыратымдылықтың арқасында PB-PCXI негізіндегі ASL және MCT талдауларымыз MP генін жеткізу әдістерін түсінуге және оңтайландыруға көмектесу үшін in vivo жалғыз және көлемді бөлшектердің динамикасы мен мінез-құлық үлгілерін зерттеуге өте қолайлы.Бұл жерде біз қолданатын әдіс SPring-8 BL20B2 сәуле сызығын қолданатын зерттеулерімізге негізделген, онда біз байқалған гендердің гетерогенді экспрессия үлгілерін түсіндіруге көмектесу үшін тышқандардың мұрын және өкпе тыныс жолдарына жалған вектордың дозасын енгізгеннен кейін сұйықтық қозғалысын визуализацияладық. біздің генімізде.тасымалдаушы дозасы бар жануарларды зерттеу 3,4.
Бұл зерттеудің мақсаты тірі егеуқұйрықтардың трахеясындағы бірқатар депутаттардың in vivo қозғалысын визуализациялау үшін PB-PCXI синхротронын пайдалану болды.Бұл PB-PCXI кескіндеу зерттеулері MP сериясын, магнит өрісінің күшін және олардың MP қозғалысына әсерін анықтау үшін орынды тексеруге арналған.Біз сыртқы магнит өрісі жеткізілген МҚ қалуына немесе мақсатты аймаққа өтуіне көмектеседі деп болжадық.Бұл зерттеулер сонымен қатар тұндырудан кейін трахеяда қалған бөлшектердің мөлшерін барынша арттыратын магнит конфигурацияларын анықтауға мүмкіндік берді.Зерттеулердің екінші сериясында біз осы оңтайлы конфигурацияны егеуқұйрықтардың тыныс жолдарына LV-MPs жеткізілуі нәтижесінде пайда болатын трансдукция үлгісін көрсету үшін пайдалануды мақсат еттік. LV трансдукция тиімділігінің жоғарылауында..
Жануарларға барлық зерттеулер Аделаида университеті (M-2019-060 және M-2020-022) және SPring-8 Synchrotron Animal этика комитеті бекіткен хаттамаларға сәйкес жүргізілді.Эксперимент ARRIVE ұсыныстарына сәйкес жүргізілді.
Барлық рентгендік суреттер Жапониядағы SPring-8 синхротронында BL20XU сәуле сызығында бұрын сипатталғанға ұқсас орнату арқылы түсірілген21,22.Қысқаша айтқанда, тәжірибелік қорап синхротронды сақтау сақинасынан 245 м қашықтықта орналасқан.Үлгіден детекторға дейінгі 0,6 м қашықтық бөлшектерді кескіндеу зерттеулері үшін және фазалық контраст әсерлерін жасау үшін in vivo кескіндеу зерттеулері үшін 0,3 м қолданылады.Энергиясы 25 кВ монохроматикалық сәуле қолданылды.Суреттер sCMOS детекторымен біріктірілген жоғары ажыратымдылықтағы рентгендік түрлендіргіштің (SPring-8 BM3) көмегімен алынды.Түрлендіргіш рентген сәулелерін қалыңдығы 10 мкм сцинтиллятордың (Gd3Al2Ga3O12) көмегімен көрінетін жарыққа түрлендіреді, содан кейін ол ×10 (NA 0,3) микроскоп объектісі арқылы sCMOS сенсорына бағытталады.sCMOS детекторы массив өлшемі 2048 × 2048 пиксель және өңделмеген пиксель өлшемі 6,5 × 6,5 мкм болатын Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Жапония) болды.Бұл параметр 0,51 мкм тиімді изотропты пиксел өлшемін және шамамен 1,1 мм × 1,1 мм көру өрісін береді.100 мс экспозиция ұзақтығы тыныс алудан туындаған қозғалыс артефактілерін азайту кезінде тыныс жолдарының ішіндегі және сыртындағы магниттік бөлшектердің сигнал-шу қатынасын барынша арттыру үшін таңдалды.In vivo зерттеулері үшін экспозициялар арасындағы рентген сәулесін блоктау арқылы сәулелену дозасын шектеу үшін рентгендік жолға жылдам рентгендік ысырма орналастырылды.
LV медиасы SPring-8 PB-PCXI кескіндеу зерттеулерінде пайдаланылмады, себебі BL20XU бейнелеу камерасы биоқауіпсіздік деңгейі 2 сертификатталмаған.Оның орнына біз екі коммерциялық жеткізушіден әртүрлі өлшемдерді, материалдарды, темір концентрацияларын және қолданбаларды қамтитын жақсы сипатталған МП диапазонын таңдадық - алдымен магнит өрістерінің шыны капиллярлардағы МП қозғалысына қалай әсер ететінін түсіну үшін, содан кейін тірі тыныс жолдары.беті.МП өлшемі 0,25-тен 18 мкм-ге дейін өзгереді және әртүрлі материалдардан жасалған (1-кестені қараңыз), бірақ әрбір үлгінің құрамы, оның ішінде МП-дегі магниттік бөлшектердің өлшемі белгісіз.19, 20, 21, 23, 24 кеңейтілген MCT зерттеулеріне сүйене отырып, біз МП қозғалысының жақсартылған көрінуін көру үшін дәйекті кадрларды алып тастау арқылы, мысалы, трахеяның тыныс алу жолының бетінде 5 мкм-ге дейінгі МП-ны көруге болады деп күтеміз.0,25 мкм бір МП бейнелеу құрылғысының ажыратымдылығынан кішірек, бірақ PB-PCXI олардың көлемдік контрастын және тұндырылғаннан кейін тұндырылған беттік сұйықтықтың қозғалысын анықтайды деп күтілуде.
Кестедегі әрбір МП үшін үлгілер.1 ішкі диаметрі 0,63 мм болатын 20 мкл шыны капиллярларда (Drummond Microcaps, PA, АҚШ) дайындалды.Корпускулярлы бөлшектер суда, ал CombiMag бөлшектері өндірушінің патенттелген сұйықтығында бар.Әрбір түтік жартылай сұйықтықпен толтырылған (шамамен 11 мкл) және үлгі ұстағышқа орналастырылған (1-суретті қараңыз).Шыны капиллярлар сәйкесінше бейнелеу камерасындағы сахнаға көлденең орналастырылып, сұйықтықтың шетіне орналастырылды.Сирек жер, неодим, темір және бордан (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) диаметрі 19 мм (ұзындығы 28 мм) никель қабықшасы магниті 1,17 Т ремененсімен бекітілді. қол жеткізу үшін бөлек тасымалдау кестесі. Көрсету кезінде позицияңызды қашықтан өзгертіңіз.Рентгендік бейнелеу магнит үлгіден шамамен 30 мм жоғары орналасқанда және кескіндер секундына 4 кадрмен алынған кезде басталады.Бейнелеу кезінде магнит шыны капиллярлық түтікке жақындатылды (шамамен 1 мм қашықтықта), содан кейін өріс күші мен орналасуының әсерін бағалау үшін түтік бойымен жылжытылды.
xy үлгісін аудару сатысында шыны капиллярлардағы МП үлгілерін қамтитын in vitro бейнелеу қондырғысы.Рентген сәулесінің жолы қызыл нүктелі сызықпен белгіленген.
Депутаттардың in vitro көріну мүмкіндігі орнатылғаннан кейін олардың ішкі жиыны жабайы түрдегі аналық Wistar альбинос егеуқұйрықтарында (~12 апталық, ~200 г) in vivo сыналды.Медетомидин 0,24 мг/кг (Домитор®, Зеноак, Жапония), мидазолам 3,2 мг/кг (Дормикум®, Астеллас Фарма, Жапония) және буторфанол 4 мг/кг (Веторфале®, Мэйдзи Сейка).Егеуқұйрықтар фарма (Жапония) қоспасымен құрсақішілік инъекция арқылы жансыздандырылды.Анестезиядан кейін олар трахеяның айналасындағы жүнді алып тастау, эндотрахеальды түтік (ET; 16 Ga ішілік каннула, Terumo BCT) енгізу және термиялық қапшықты қамтитын тапсырыс бойынша жасалған бейнелеу пластинасының үстінде жатқан күйде иммобилизациялау арқылы бейнелеуге дайындалды. дене температурасын ұстап тұру үшін.22. Содан кейін кескіндеу тақтасы 2a суретінде көрсетілгендей рентгендік кескінде трахеяны көлденеңінен туралау үшін кескіндеу қорабындағы үлгі сатысына сәл бұрышпен бекітілді.
(a) SPring-8 бейнелеу құрылғысындағы in vivo кескінді орнату, қызыл нүктелі сызықпен белгіленген рентген сәулесінің жолы.(b,c) Трахеальды магнитті локализациялау екі ортогональды орнатылған IP камералары арқылы қашықтан орындалды.Экрандағы кескіннің сол жағында басын ұстап тұрған сым ілмегін және ET түтігінің ішіне орнатылған жеткізу канюлясын көруге болады.
100 мкл шыны шприцті пайдаланатын қашықтан басқарылатын шприц сорғы жүйесі (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 30 Ga ине арқылы PE10 түтігіне (0,61 мм OD, 0,28 мм ID) қосылды.Эндотрахеальды түтікшені енгізген кезде ұшының трахеяда дұрыс орналасуын қамтамасыз ету үшін түтікшені белгілеңіз.Микросорғыны пайдаланып, шприц поршені алынып, түтіктің ұшы жеткізілетін МП үлгісіне батырылды.Жүктелген жеткізу түтігі содан кейін эндотрахеальді түтікке салынып, ұшын күтілетін магнит өрісінің ең күшті бөлігіне орналастырды.Кескінді алу Arduino негізіндегі уақыт қорабына қосылған тыныс детекторы арқылы басқарылды және барлық сигналдар (мысалы, температура, тыныс алу, ысырманы ашу/жабу және кескінді алу) Powerlab және LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) көмегімен жазылды. 22 Бейнелеу кезінде Корпус қолжетімсіз болған кезде екі IP камерасы (Panasonic BB-SC382) бір-біріне шамамен 90° орналасты және бейнелеу кезінде трахеяға қатысты магниттің орнын бақылау үшін пайдаланылды (2b, c-сурет).Қозғалыс артефактілерін азайту үшін тыныс алу ағынының терминалдық платосы кезінде әр тыныс үшін бір сурет алынды.
Магнит бейнелеу корпусының сыртында қашықтан орналасуы мүмкін екінші сатыға бекітілген.Магниттің әртүрлі позициялары мен конфигурациялары сыналған, соның ішінде: трахеядан шамамен 30 ° бұрышта орналастырылған (конфигурациялар 2a және 3a суреттерінде көрсетілген);бір магнит жануардың үстінде, екіншісі төменде, полюстер тартылу үшін орнатылған (3б-сурет)., бір магнит жануардың үстінде және біреуі төменде, полюстер итеру үшін орнатылған (3c-сурет) және бір магнит жоғарыда және трахеяға перпендикуляр (3d-сурет).Жануар мен магнитті орнатқаннан және сыналатын МП-ны шприц сорғысына жүктегеннен кейін, кескіндерді алғаннан кейін 4 мкл/сек жылдамдықпен 50 мкл дозасын беріңіз.Содан кейін магнит трахеяның бойымен немесе бойымен алға-артқа жылжытылады, сонымен бірге кескіндерді алуды жалғастырады.
In vivo бейнелеуге арналған магнит конфигурациясы (a) трахеяның үстінде шамамен 30° бұрышта бір магнит, (b) тарту үшін конфигурацияланған екі магнит, (c) кері тарту үшін конфигурацияланған екі магнит, (d) бір магниттің үстінде және перпендикуляр трахея.Бақылаушы трахея арқылы ауыздан өкпеге қарады және рентген сәулесі егеуқұйрықтың сол жағынан өтіп, оң жағынан шықты.Магнит тыныс алу жолының бойымен немесе рентген сәулесінің бағыты бойынша трахеяның үстінде солға және оңға жылжытылады.
Біз сондай-ақ тыныс алу мен жүрек соғу жиілігінің араласуы болмаған кезде тыныс алу жолдарындағы бөлшектердің көрінуі мен мінез-құлқын анықтауға тырыстық.Сондықтан, бейнелеу кезеңінің соңында пентобарбиталдың артық дозалануына байланысты жануарлар адамдық эвтанизацияға ұшырады (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кроссинг, АҚШ; ~65 мг/кг ip).Кейбір жануарлар бейнелеу платформасында қалдырылды, тыныс алу және жүрек соғысы тоқтағаннан кейін тыныс алу жолының бетінде МП көрінбесе, қосымша МП дозасын қосып, кескіндеу процесі қайталанды.
Алынған кескіндер тегіс және күңгірт өріс үшін түзетілді, содан кейін MATLAB (R2020a, The Mathworks) жүйесінде жазылған теңшелетін сценарий арқылы фильмге (секундына 20 кадр; тыныс алу жиілігіне байланысты 15–25 × қалыпты жылдамдық) жинақталды.
LV генінің векторын жеткізуге қатысты барлық зерттеулер Аделаида университетінің зертханалық жануарларды зерттеу орталығында жүргізілді және SPring-8 экспериментінің нәтижелерін магнит өрісі болған кезде LV-MP жеткізуі in vivo геннің тасымалдануын күшейте алатынын бағалау үшін пайдалануға бағытталған. .MF және магнит өрісінің әсерін бағалау үшін жануарлардың екі тобы өңделді: бір топқа магнитті орналастыратын LV MF инъекциясы, ал екінші топқа магнитсіз LV MF бар бақылау тобы енгізілді.
LV генінің векторлары бұрын сипатталған 25, 26 әдістерді қолдану арқылы жасалды.LacZ векторы MPSV конститутивтік промоторы (LV-LacZ) басқаратын ядролық локализацияланған бета-галактозидаза генін білдіреді, ол трансдукцияланған жасушаларда өкпе тінінің фронттары мен бөліктерінде көрінетін көк реакция өнімін шығарады.Титрлеу ТУ/мл-де титрді есептеу үшін гемоцитометрдің көмегімен LacZ-оң жасушалардың санын қолмен санау арқылы жасуша дақылдарында орындалды.Тасымалдаушылар -80°C температурада криоконсервіленген, қолданар алдында ерітілген және жеткізілім алдында 1:1 араластыру және мұзда кем дегенде 30 минут инкубациялау арқылы CombiMag-ге байланыстырылады.
Қалыпты Sprague Dawley егеуқұйрықтары (n = 3/топ, ~2-3 жансыздандырылған ip 0,4 мг/кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австралия) және 60 мг/кг кетамин (Ilium, Австралия) 1 айлық кезінде) ip ) 16 Га тамырішілік канюлямен инъекциялық және хирургиялық емес ауызша каннуляция.Трахеальді тыныс жолдарының тінінің LV трансдукциясын алуын қамтамасыз ету үшін ол трахеяның тыныс алу жолының бетін сым себетпен осьтік жағымен ысқылаған біздің бұрын сипатталған механикалық бұзылу хаттамасы арқылы кондицияланды (N-Circle, ұшы жоқ нитинол тасты сорғыш NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, АҚШ) 30 p28.Содан кейін биоқауіпсіздік кабинетіндегі бұзылудан шамамен 10 минут өткен соң, LV-MP трахеальді енгізу жүргізілді.
Бұл тәжірибеде пайдаланылған магнит өрісі in vivo рентгендік зерттеуге ұқсас конфигурацияланған, дәл сол магниттер дистилляциялық стент қысқыштары бар трахеяның үстінде ұсталған (4-сурет).50 мкл көлемді (2 x 25 мкл аликвота) LV-MP трахеяға (n = 3 жануар) бұрын сипатталғандай гельі бар тамшуыр арқылы жеткізілді.Бақылау тобы (n = 3 жануар) магнитті пайдаланбай бірдей LV-MP алды.Инфузия аяқталғаннан кейін канюля эндотрахеальды түтіктен шығарылады және жануар экстубацияланады.Магнит шешілмес бұрын 10 минут орнында қалады.Егеуқұйрықтарға тері астына мелоксикам (1 мл/кг) енгізілді (Ilium, Австралия), содан кейін 1 мг/кг атипамазол гидрохлоридін (Антиседан, Зоетис, Австралия) интраперитонеальді инъекция арқылы анестезия тоқтатылды.Егеуқұйрықтар анестезиядан толық қалпына келгенше жылы ұсталды және бақыланды.
Биологиялық қауіпсіздік шкафындағы LV-MP жеткізу құрылғысы.ET түтігінің ашық сұр Luer-lock жеңінің ауыздан шығып тұрғанын және суретте көрсетілген гель тамшуырының ұшы ET түтігі арқылы трахеяға қажетті тереңдікке енгізілгенін көруге болады.
LV-MP енгізу процедурасынан кейін бір аптадан кейін жануарлар 100% CO2 ингаляциясы арқылы адами құрбандыққа шалынды және LacZ экспрессиясы стандартты X-gal өңдеуіміз арқылы бағаланды.Эндотрахеальді түтіктің орналасуына байланысты кез келген механикалық зақымдану немесе сұйықтықтың сақталуы талдауға қосылмауы үшін үш ең каудальды шеміршек сақиналары жойылды.Талдау үшін екі жарты алу үшін әрбір трахея ұзына бойына кесілді және люминальды бетті визуализациялау үшін Minutien инесін (Fine Science Tools) пайдаланып, силикон резеңкесі (Sylgard, Dow Inc) бар шыныаяққа орналастырылды.Трансдукцияланған жасушалардың таралуы мен сипаты DigiLite камерасы және TCapture бағдарламалық құралымен (Tucsen Photonics, Қытай) Nikon микроскопының (SMZ1500) көмегімен фронтальды фотосурет арқылы расталды.Кескіндер 20 есе үлкейту кезінде (трахеяның толық еніне арналған максималды параметрді қоса) алынды, трахеяның бүкіл ұзындығы кезең-кезеңімен көрсетіліп, кескіндердің «тігілуіне» мүмкіндік беру үшін әрбір кескіннің арасында жеткілікті қабаттасу қамтамасыз етілді.Әр трахеядағы кескіндер жазық қозғалыс алгоритмі арқылы Composite Image Editor 2.0.3 (Microsoft Research) нұсқасын пайдаланып, бір композициялық кескінге біріктірілді. Әрбір жануардың трахеялық композициялық кескіндеріндегі LacZ экспрессиясының аумағы 0,35 < Реңк < 0,58, Қанықтылық > 0,15 және Мән < 0,7 параметрлерін пайдалана отырып, бұрын сипатталғандай28 автоматтандырылған MATLAB сценарийі (R2020a, MathWorks) арқылы сандық анықталды. Әрбір жануардың трахеялық композициялық кескіндеріндегі LacZ экспрессиясының ауданы 0,35 < Реңк < 0,58, Қанықтылық > 0,15 және Мән < 0,7 параметрлерін қолдана отырып, бұрын сипатталғандай28 автоматтандырылған MATLAB сценарийі (R2020a, MathWorks) арқылы сандық анықталды. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), қалай описано ranee28, <50, <50, <50, <50, <50, <50, <50, <<50, <50, <<50, <<50, <50, <<50, <<50, <<50, <<50, | ,7. Әрбір жануардан алынған композициялық трахеялық кескіндердегі LacZ экспрессиясының ауданы бұрын сипатталғандай28 автоматтандырылған MATLAB сценарийінің (R2020a, MathWorks) көмегімен 0,35 параметрлері арқылы сандық анықталды.0,15 және мәні<0,7.如 前所 述, 使用 自动 自动 自动 自动 自动 自动 (R2020a, MathWorks) 对 来自 每 每 只 动物 的 的 气管 来自 图像 中 中 气管 图像 图像 图像 中 中 中 图像 图像 图像 中 中 中 中 量化, 使用 0.35 <色调 0.35 <色调 0.58, 饱和度> 0,58, 饱和度> 0,7, 0,7, 饱和度> 0,7 和值> 0,7 饱和度>如 前所 述, 自动 自动 自动 自动 自动 自动 ((R2020a, MathWorks) 来自 每 只 的 气管 气管 复合 复合 图像 的 的 的 的 的 表达 图像 的 的 的 的 表达的表达 的 的 的 的 的 的 表达 表达 的 的 的 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58,> 0.15 和值 <0.7 和值 <0.7 和值 ...... …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определили с использованием автоматизованных сценарий MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 08, <570, <<570, . Әрбір жануардың трахеясының композициялық кескіндеріндегі LacZ экспрессиясының аумақтары 0,35 < реңк < 0,58, қанықтығы > 0,15 және мән < 0,7 параметрлері арқылы бұрын сипатталғандай автоматтандырылған MATLAB сценарийінің (R2020a, MathWorks) көмегімен сандық анықталды.GIMP v2.10.24 нұсқасында тіндердің контурларын қадағалау арқылы тін аймағын анықтау және трахея тінінен тыс кез келген жалған анықтауларды болдырмау үшін әрбір композициялық кескін үшін маска қолмен жасалды.Әрбір жануардың барлық композициялық кескіндеріндегі боялған аумақтар сол жануардың жалпы боялған аймағын беру үшін қосылды.Содан кейін қалыпты аймақты алу үшін боялған аймақ масканың жалпы ауданына бөлінді.
Әрбір трахея парафинге салынып, қалыңдығы 5 мкм кесінді.Бөлімдер 5 минут бойы бейтарап жылдам қызыл түспен боялды және кескіндер Nikon Eclipse E400 микроскопы, DS-Fi3 камерасы және NIS элементін түсіру бағдарламалық құралының (5.20.00 нұсқасы) көмегімен алынды.
Барлық статистикалық талдаулар GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) ішінде орындалды.Статистикалық маңыздылық p ≤ 0,05 деңгейінде белгіленді.Қалыптылық Шапиро-Вилк сынағы арқылы тексерілді және LacZ бояуындағы айырмашылықтар жұпталмаған t-сынағы арқылы бағаланды.
1-кестеде сипатталған алты МП PCXI арқылы зерттелді, ал көріну 2-кестеде сипатталған. Екі полистирол МП (MP1 және MP2; тиісінше 18 мкм және 0,25 мкм) PCXI арқылы көрінбеді, бірақ қалған үлгілерді анықтауға болады. (мысалдар 5-суретте көрсетілген).MP3 және MP4 нашар көрінеді (10-15% Fe3O4; сәйкесінше 0,25 мкм және 0,9 мкм).MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) құрамында сыналған ең кішкентай бөлшектер болғанымен, ол ең айқын болды.CombiMag MP6 өнімін ажырату қиын.Барлық жағдайларда магнитті капиллярға параллель алға-артқа жылжыту арқылы MF-ті анықтау қабілетіміз айтарлықтай жақсарды.Магниттер капиллярдан алыстаған сайын бөлшектер ұзын тізбектермен шығарылды, бірақ магниттер жақындаған сайын және магнит өрісінің күші артқан сайын бөлшектердің тізбегі қысқарды, өйткені бөлшектер капиллярдың үстіңгі бетіне қарай жылжиды (Қосымша бейне S1 қараңыз). : MP4), бетіндегі бөлшектердің тығыздығын арттыру.Керісінше, магнит капиллярдан шығарылғанда, өріс күші төмендейді және МП капиллярдың жоғарғы бетінен созылатын ұзын тізбектерге қайта орналасады (Қосымша бейне S2: MP4 қараңыз).Магнит қозғалысын тоқтатқаннан кейін бөлшектер тепе-теңдік жағдайына жеткеннен кейін біраз уақыт қозғала береді.МП капиллярдың жоғарғы бетіне қарай және одан алыстаған кезде магниттік бөлшектер сұйықтық арқылы қоқыстарды тартуға бейім.
PCXI астында MP көрінуі үлгілер арасында айтарлықтай өзгереді.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 және (d) MP6.Мұнда көрсетілген барлық суреттер капиллярдан шамамен 10 мм жоғары орналасқан магнитпен түсірілген.Көрінетін үлкен шеңберлер капиллярларда ұсталған ауа көпіршіктері болып табылады, олар фазалық контраст кескінінің ақ және қара жиектерінің ерекшеліктерін анық көрсетеді.Қызыл жолақ контрастты арттыратын үлкейтуді көрсетеді.Барлық сандардағы магнит тізбектерінің диаметрлері масштабталмағанын және көрсетілгеннен шамамен 100 есе үлкен екенін ескеріңіз.
Магнит капиллярдың үстіңгі жағында солға және оңға жылжыған кезде, МП жолының бұрышы магнитпен теңестіру үшін өзгереді (6-суретті қараңыз), осылайша магнит өрісінің сызықтарын сызады.MP3-5 үшін аккорд шекті бұрышқа жеткеннен кейін бөлшектер капиллярдың жоғарғы беті бойымен сүйрейді.Бұл көбінесе МП-ның магнит өрісі ең күшті жеріне жақын жерде үлкен топтарға шоғырлануына әкеледі (Қосымша бейне S3: MP5 қараңыз).Бұл әсіресе капиллярдың соңына жақын суретке түсіру кезінде айқын көрінеді, бұл МП-ның сұйықтық-ауа интерфейсінде шоғырлануын және шоғырлануын тудырады.MP3-5-ке қарағанда ажырату қиынырақ болатын MP6-дағы бөлшектер магнит капилляр бойымен қозғалған кезде сүйретілмеді, бірақ MP жіптері диссоциацияланып, бөлшектер көріністе қалды (Қосымша бейне S4: MP6 қараңыз).Кейбір жағдайларда магнитті бейнелеу орнынан ұзақ қашықтыққа жылжыту арқылы қолданылған магнит өрісі азайған кезде, қалған МП-лар жіпте қалып, ауырлық күшімен түтіктің төменгі бетіне баяу түседі (Қосымша бейне S5: MP3 қараңыз) .
МП жолының бұрышы магнит капиллярдың үстінде оңға қарай жылжыған сайын өзгереді.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 және (d) MP6.Қызыл жолақ контрастты арттыратын үлкейтуді көрсетеді.Қосымша бейнелер ақпараттық мақсаттарға арналғанын ескеріңіз, өйткені олар маңызды бөлшектер құрылымын және осы статикалық кескіндерде бейнеленбейтін динамикалық ақпаратты ашады.
Біздің сынақтарымыз магнитті трахея бойымен алға-артқа баяу жылжыту in vivo күрделі қозғалыс контекстінде MF визуализациясын жеңілдететінін көрсетті.Полистирол түйіршіктері (MP1 және MP2) капиллярда көрінбейтіндіктен in vivo сынақтары жүргізілмеді.Қалған төрт MF-тің әрқайсысы магниттің ұзын осі трахеяның үстінде вертикальға шамамен 30° бұрышта орналасқан in vivo сынақтан өтті (2b және 3a суреттерін қараңыз), себебі бұл ұзағырақ MF тізбектеріне әкелді және тиімдірек болды. магнитке қарағанда..конфигурация тоқтатылды.MP3, MP4 және MP6 тірі жануарлардың трахеясында табылған жоқ.Жануарларды адам өлтіргеннен кейін егеуқұйрықтардың тыныс алу жолдарын визуализациялау кезінде бөлшектер шприцті сорғы арқылы қосымша көлем қосқанда да көрінбейтін болып қала берді.MP5 құрамында темір оксидінің ең жоғары мөлшері болды және жалғыз көрінетін бөлшек болды, сондықтан ол MP әрекетін in vivo бағалау және сипаттау үшін пайдаланылды.
MF енгізу кезінде магнитті трахеяның үстіне орналастыру көптеген МФ-ның барлығы емес, көру өрісінде шоғырлануына әкелді.Бөлшектердің трахеяға енуі адам эвтанизацияланған жануарларда жақсы байқалады.7-сурет және қосымша бейне S6: MP5 вентральды трахеяның бетіндегі бөлшектердің жылдам магниттік түсірілуін және туралануын көрсетеді, бұл МП трахеяның қажетті аймақтарына бағытталуы мүмкін екенін көрсетеді.MF жеткізілгеннен кейін трахея бойымен дистальды іздестіру кезінде кейбір MFs каринаға жақынырақ табылды, бұл барлық MFs жинау және ұстау үшін магнит өрісінің күші жеткіліксіз екенін көрсетеді, өйткені олар сұйықтықты енгізу кезінде магнит өрісінің максималды күші аймағы арқылы жеткізілді.процесс.Дегенмен, босанғаннан кейінгі МП концентрациясы кескін аймағының айналасында жоғары болды, бұл көптеген МП қолданылған магнит өрісінің күші ең жоғары болатын тыныс жолдары аймақтарында қалғанын көрсетеді.
(а) бейнелеу аймағының дәл үстінде орналасқан магниті бар жақында эвтанизацияланған егеуқұйрықтың трахеясына MP5 жеткізілгенге дейін және (б) суреттері.Бейнеленген аймақ шеміршекті екі сақина арасында орналасқан.МП жеткізілгенге дейін тыныс алу жолдарында біраз сұйықтық бар.Қызыл жолақ контрастты арттыратын үлкейтуді көрсетеді.Бұл суреттер S6: MP5 қосымша бейнеде көрсетілген бейнеден алынған.
Магнитті трахея бойымен in vivo жылжыту тыныс алу жолының бетіндегі МП тізбегінің бұрышының капиллярларда байқалғанға ұқсас өзгеруіне әкелді (8-суретті және S7 Қосымша бейнені қараңыз: MP5).Дегенмен, біздің зерттеуімізде депутаттарды капиллярлар сияқты тірі тыныс алу жолдарының бетімен сүйреп апару мүмкін болмады.Кейбір жағдайларда магнитті солға және оңға жылжытқанда МП тізбегі ұзарады.Бір қызығы, біз сондай-ақ бөлшектер тізбегі магнитті трахея бойымен бойлық жылжытқанда сұйықтықтың беткі қабатының тереңдігін өзгертетінін және магнитті тікелей жоғары жылжытқанда және бөлшектер тізбегін тік күйге айналдырғанда кеңейетінін анықтадық (қараңыз. Қосымша бейне S7).: MP5 0:09, төменгі оң жақ).Магнит трахеяның үстіңгі жағында (яғни, трахеяның ұзындығы бойымен емес, жануардың сол немесе оң жағына) көлденең жылжытылған кезде тән қозғалыс үлгісі өзгерді.Қозғалыс кезінде бөлшектер әлі де анық көрінді, бірақ магнит трахеядан шығарылған кезде бөлшектердің жіптерінің ұштары көрінді (Қосымша бейне S8: MP5, 0:08 бастап қараңыз).Бұл шыны капиллярдағы қолданылған магнит өрісінің әсерінен магнит өрісінің байқалатын әрекетімен сәйкес келеді.
Тірі анестезияланған егеуқұйрықтың трахеясында MP5 көрсететін үлгі суреттер.(а) Магнит трахеяның үстінде және сол жағындағы кескіндерді алу үшін қолданылады, содан кейін (b) магнитті оңға жылжытқаннан кейін.Қызыл жолақ контрастты арттыратын үлкейтуді көрсетеді.Бұл суреттер S7-нің қосымша бейнесіндегі бейнеден алынған: MP5.
Екі полюсті трахеядан жоғары және төмен солтүстік-оңтүстік бағытта баптағанда (яғни тарту; 3б-сурет) МП хордалары ұзағырақ пайда болды және трахеяның дорсальды бетінде емес, трахеяның бүйір қабырғасында орналасты. трахея (Қосымшаны қараңыз).Бейне S9: MP5).Дегенмен, бір жерде (яғни, трахеяның дорсальды беті) бөлшектердің жоғары концентрациясы қос магнитті құрылғыны пайдаланып сұйықтықты енгізгеннен кейін анықталмады, бұл әдетте бір магниттік құрылғымен кездеседі.Содан кейін, бір магнит қарама-қарсы полюстерді қайтару үшін конфигурацияланған кезде (3c-сурет), көру өрісінде көрінетін бөлшектердің саны жеткізілгеннен кейін көбейген жоқ.Екі магнит конфигурациясын орнату магниттерді тартатын немесе итеретін жоғары магнит өрісінің күшіне байланысты қиын.Содан кейін қондырғы тыныс алу жолдарына параллель, бірақ күш сызықтары трахея қабырғасын ортогональді түрде кесіп өтетіндей етіп 90 градус бұрышта өтетін жалғыз магнитке өзгертілді (3d-сурет), бұл бағытта бөлшектердің агрегация мүмкіндігін анықтауға арналған. бүйір қабырғасы.байқалуы.Дегенмен, бұл конфигурацияда анықталатын MF жинақтау қозғалысы немесе магнит қозғалысы болған жоқ.Барлық осы нәтижелерге сүйене отырып, гендік тасымалдаушыларды in vivo зерттеулері үшін бір магнитті және 30 градустық бағдары бар конфигурация таңдалды (сурет 3a).
Жануарды адамдық құрбандыққа шалғаннан кейін бірден бірнеше рет суретке түсіргенде, кедергі жасайтын тін қозғалысының болмауы магниттің трансляциялық қозғалысына сәйкес «тербеліс» айқын шеміршек аралық өрісте ұсақ, қысқа бөлшектер сызықтарын байқауға болатынын білдіреді.MP6 бөлшектерінің болуын және қозғалысын анық көріңіз.
LV-LacZ титрі 1,8 x 108 ХБ/мл болды және CombiMag MP (MP6) 1:1 араластырғаннан кейін жануарларға 9 x 107 ХБ/мл LV көлік құралының 50 мкл трахеялық дозасы енгізілді (яғни 4,5). x 106 TU/егеуқұйрық).).).Бұл зерттеулерде, еңбек кезінде магнитті жылжытудың орнына, біз магнитті бір позицияға бекіттік, егер LV трансдукциясы (а) магнит өрісі болмаған кезде векторлық жеткізіліммен салыстырғанда жақсаруы мүмкін, және (b) тыныс алу жолы мүмкін бе? назар аударыңыз.Жасушалар жоғарғы тыныс жолдарының магниттік мақсатты аймақтарында трансдукцияланады.
Магниттердің болуы және CombiMag-ті LV векторларымен бірге пайдалану біздің стандартты LV векторын жеткізу хаттамасы сияқты жануарлардың денсаулығына теріс әсер етпеді.Механикалық күйзеліске ұшыраған трахея аймағының фронтальды суреттері (қосымша 1-сурет) LV-MP өңделген топта магниттің қатысуымен трансдукцияның айтарлықтай жоғары деңгейлері бар екенін көрсетті (9а-сурет).Бақылау тобында көгілдір LacZ бояуының аз ғана мөлшері болды (сурет 9b).X-Gal-боялған нормаланған аймақтарды сандық анықтау магнит өрісі болған кезде LV-MP енгізу шамамен 6 есе жақсартуға әкелетінін көрсетті (9c-сурет).
LV-MP (a) магнит өрісі болған кезде және (b) магнитсіз трахеальды трансдукцияны көрсететін композиттік кескіндердің мысалы.(c) магнитті қолдану арқылы трахеядағы LacZ трансдукциясының қалыпқа келтірілген аймағында статистикалық маңызды жақсарту (*p = 0,029, t-тест, n = 3 топ үшін, орташа ± стандартты қате).
Бейтарап жылдам қызыл боялған секциялар (қосымша 2-суретте көрсетілген мысал) LacZ-боялған жасушалардың бұрын хабарланған үлгіде және сол жерде болғанын көрсетті.
Тыныс алу жолдарының гендік терапиясындағы негізгі мәселе қызығушылық аймақтарында тасымалдаушы бөлшектерді дәл локализациялау және ауа ағыны мен белсенді шырыш клиренсі болған кезде мобильді өкпеде трансдукция тиімділігінің жоғары деңгейіне жету болып қала береді.Муковисцидозда респираторлық ауруларды емдеуге арналған LV тасымалдаушылары үшін өткізгіш тыныс жолдарында тасымалдаушы бөлшектердің болу уақытын ұлғайту осы уақытқа дейін қол жетімсіз мақсат болды.Castellani және т.б. атап өткендей, трансдукцияны жақсарту үшін магнит өрістерін пайдалану электропорация сияқты генді жеткізудің басқа әдістерінен артықшылықтарға ие, өйткені ол қарапайымдылықты, үнемділікті, локализацияланған жеткізуді, тиімділікті арттыруды және инкубация уақытын қысқарта алады.және, мүмкін, көлік құралының төмен дозасы10.Дегенмен, сыртқы магниттік күштердің әсерінен тыныс жолдарындағы магниттік бөлшектердің in vivo тұндыру және мінез-құлқы ешқашан сипатталмаған және іс жүзінде бұл әдістің тірі тыныс алу жолдарында гендердің экспрессия деңгейін арттыру мүмкіндігі in vivo көрсетілмеген.
PCXI синхротронындағы in vitro эксперименттеріміз MP полистиролды қоспағанда, біз сынаған барлық бөлшектер біз пайдаланған бейнелеу қондырғысында көрінетінін көрсетті.Магнит өрісі болған кезде магнит өрістері жолдарды құрайды, олардың ұзындығы бөлшектердің түріне және магнит өрісінің күшіне (яғни, магниттің жақындығы мен қозғалысына) байланысты.10-суретте көрсетілгендей, біз байқап отырған жолдар әрбір жеке бөлшек магниттеліп, өзінің жергілікті магнит өрісін индукциялағанда пайда болады.Бұл бөлек өрістер басқа бөлшектердің жергілікті тартылу және тебілу күштерінің жергілікті күштерінің әсерінен топтық жіп қозғалыстарымен басқа ұқсас бөлшектердің жиналуын және қосылуын тудырады.
Диаграмма (a, b) сұйықтық толтырылған капиллярлардың және (c, d) ауамен толтырылған трахеяның ішінде түзілетін бөлшектердің тізбектерін көрсетеді.Капиллярлар мен трахея масштабта тартылмағанын ескеріңіз.(а) панелінде сонымен қатар тізбекте орналасқан Fe3O4 бөлшектері бар MF сипаттамасы бар.
Магнит капиллярдың үстінен қозғалған кезде бөлшектер тізбегінің бұрышы Fe3O4 бар MP3-5 үшін критикалық шекке жетті, содан кейін бөлшектер тізбегі бұрынғы орнында қалмай, бет бойымен жаңа орынға жылжыды.магнит.Бұл әсер шыны капиллярдың беті осы қозғалыстың орын алуына мүмкіндік беретіндей тегіс болғандықтан орын алуы мүмкін.Бір қызығы, MP6 (CombiMag) бұлай әрекет етпеді, бәлкім, бөлшектер кішірек болғандықтан, басқа жабын немесе бет заряды болды немесе меншікті тасымалдаушы сұйықтық олардың қозғалу қабілетіне әсер етті.CombiMag бөлшектерінің кескініндегі контраст да әлсіз, бұл сұйықтық пен бөлшектердің тығыздығы бірдей болуы мүмкін, сондықтан бір-біріне оңай жылжи алмайды.Магнит тым жылдам қозғалса, бөлшектер де тұрып қалуы мүмкін, бұл магнит өрісінің күші сұйықтықтағы бөлшектер арасындағы үйкелісті әрқашан жеңе алмайтынын көрсетеді, бұл магнит өрісінің күші мен магнит пен мақсатты аймақтың арасындағы қашықтыққа сәйкес келмеуі керек дегенді білдіреді. таң қалдыру.маңызды.Бұл нәтижелер сонымен қатар магниттер мақсатты аймақ арқылы ағып жатқан көптеген микробөлшектерді ұстай алатынына қарамастан, CombiMag бөлшектерін трахеяның беті бойымен жылжыту үшін магниттерге сену екіталай екенін көрсетеді.Осылайша, біз in vivo LV MF зерттеулерінде тыныс жолдары ағашының нақты аймақтарын физикалық нысанаға алу үшін статикалық магнит өрістерін пайдалану керек деген қорытындыға келдік.
Бөлшектер денеге жеткізілгеннен кейін, оларды дененің күрделі қозғалатын тінінің контекстінде анықтау қиын, бірақ оларды анықтау мүмкіндігі магнитті трахеяның үстінен көлденең бағытта жылжыту арқылы MP жіптерін «айналдыру» арқылы жақсартылды.Нақты уақытта бейнелеу мүмкін болғанымен, жануарды адам өлтіргеннен кейін бөлшектердің қозғалысын анықтау оңайырақ.МП концентрациясы әдетте магнит бейнелеу аймағының үстінде орналасқан кезде осы жерде ең жоғары болды, дегенмен кейбір бөлшектер әдетте трахеядан төменірек табылды.In vitro зерттеулерінен айырмашылығы, бөлшектерді магниттің қозғалысы арқылы трахеяға апару мүмкін емес.Бұл нәтиже трахеяның бетін жабатын шырыштың әдетте ингаляциялық бөлшектерді қалай өңдейтініне, оларды шырышқа ұстап, кейін шырышты-цилиарлы тазарту механизмі арқылы тазартатынына сәйкес келеді.
Біз трахеяның үстінде және астындағы магниттерді тарту үшін пайдалану (3б-сурет) бір нүктеде жоғары шоғырланған магнит өрісінен гөрі біркелкі магнит өрісін тудыруы мүмкін деп болжадық, бұл бөлшектердің біркелкі таралуына әкеледі..Алайда, біздің алдын ала зерттеуіміз бұл гипотезаны растайтын нақты дәлелдер таппады.Сол сияқты магнит жұбын кері қайтару үшін орнату (3c-сурет) кескін аймағында бөлшектердің көбірек түсуіне әкелмеді.Бұл екі нәтиже қос магнитті орнату MP меңзегішінің жергілікті басқаруын айтарлықтай жақсартпайтынын және нәтижесінде пайда болатын күшті магниттік күштерді реттеу қиынға соғатынын, бұл тәсілді практикалық емес ететінін көрсетеді.Сол сияқты, магнитті трахеяның үстінен және бойымен бағыттау (3d-сурет) бейнеленген аймақта қалған бөлшектердің санын көбейткен жоқ.Осы альтернативті конфигурациялардың кейбірі сәтті болмауы мүмкін, себебі олар тұндыру аймағындағы магнит өрісінің күшінің төмендеуіне әкеледі.Осылайша, 30 градустағы жалғыз магнит конфигурациясы (3а-сурет) in vivo тестілеудің ең қарапайым және тиімді әдісі болып саналады.
LV-MP зерттеуі LV векторлары CombiMag-пен біріктірілгенде және магнит өрісінің қатысуымен физикалық бұзылудан кейін жеткізілгенде, бақылаумен салыстырғанда трахеядағы трансдукция деңгейі айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті.Синхротронды бейнелеу зерттеулері мен LacZ нәтижелеріне сүйене отырып, магнит өрісі трахеяда LV ұстап тұруға және бірден өкпеге терең енетін векторлық бөлшектердің санын азайтуға қабілетті болып шықты.Мұндай мақсатты жақсартулар жеткізілетін титрлерді, мақсатты емес трансдукцияны, қабыну және иммундық жанама әсерлерді және генді тасымалдау шығындарын азайту кезінде жоғары тиімділікке әкелуі мүмкін.Маңыздысы, өндірушінің айтуынша, CombiMag генді тасымалдаудың басқа әдістерімен, соның ішінде басқа вирустық векторлармен (мысалы, AAV) және нуклеин қышқылдарымен бірге қолданылуы мүмкін.