Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Toxoplasma gondii – жұқтырған иесінің микроортасын модуляциялайтын жасушаішілік қарапайым паразит және ми ісіктерінің өсу жиілігімен байланысты екені белгілі.Бұл зерттеуде токсоплазма инфекциясының экзосомалық miRNA-21 ми ісіктерінің өсуіне ықпал етеді деп болжаймыз.Токсоплазма жұқтырған BV2 микроглиясынан алынған экзосомалар сипатталды және U87 глиома жасушаларының интернационализациясы расталды.Экзосомалық микроРНҚ экспрессия профильдері Toxoplasma gondii және ісіктерді сұрыптаумен байланысты микроРНҚ және микроРНҚ-21A-5p массивтері арқылы талданды.Біз сондай-ақ U87 глиома жасушаларындағы ісікпен байланысты гендердің мРНҚ деңгейлерін экзосомалардағы miR-21 деңгейлерін және экзосомалардың адамның U87 глиома жасушаларының пролиферациясына әсерін өзгерту арқылы зерттедік.Toxoplasma gondii жұқтырған U87 глиома жасушаларының экзосомаларында микроРНҚ-21 экспрессиясы жоғарылайды және ісікке қарсы гендердің (FoxO1, PTEN және PDCD4) белсенділігі төмендейді.Toxoplasma жұқтырған BV2 туынды экзосомалар U87 глиома жасушаларының пролиферациясын тудырады.Экзосомалар тышқан ісік үлгісінде U87 жасушаларының өсуін тудырады.Токсоплазма жұқтырған BV2 микроглияларындағы экзосомалық miR-21 көбеюі ісікке қарсы гендерді төмендету арқылы U87 глиома жасушаларында жасуша өсу промоутері ретінде маңызды рөл атқаруы мүмкін деп болжаймыз.
2018 жылы дүние жүзінде 18,1 миллионнан астам асқынған қатерлі ісік диагнозы қойылған, жыл сайын орталық жүйке жүйесінің шамамен 297 000 ісіктері (барлық ісіктердің 1,6%)1 диагноз қойылған.Алдыңғы зерттеулер көрсеткендей, адам миының ісіктерінің даму қаупі факторларына әртүрлі химиялық өнімдер, отбасылық тарих және бас терапевтік және диагностикалық жабдықтардан иондаушы сәулелену жатады.Дегенмен, бұл қатерлі ісіктердің нақты себебі белгісіз.Дүние жүзіндегі барлық қатерлі ісіктердің шамамен 20% жұқпалы агенттер, соның ішінде вирустар, бактериялар және паразиттер3,4.Жұқпалы қоздырғыштар иесі жасушаның генетикалық механизмдерін, мысалы, ДНҚ-ны қалпына келтіру және жасушалық циклді бұзады және созылмалы қабынуға және иммундық жүйенің бұзылуына әкелуі мүмкін5.
Адамның қатерлі ісігімен байланысты жұқпалы агенттер ең көп таралған вирустық қоздырғыштар болып табылады, оның ішінде адам папилломавирустары және В және С гепатиті вирустары.Паразиттер адам қатерлі ісігінің дамуында да әлеуетті рөл атқара алады.Паразиттердің бірнеше түрлері, атап айтқанда Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis және Hymenolepis nana адам қатерлі ісігінің әртүрлі түрлеріне қатысты 6,7,8.
Toxoplasma gondii – жұқтырған хост жасушаларының микроортасын реттейтін жасушаішілік қарапайымдылар.Бұл паразит әлем халқының шамамен 30% жұқтырады және бүкіл халыққа қауіп төндіреді9,10.Toxoplasma gondii өмірлік маңызды мүшелерді, соның ішінде орталық жүйке жүйесін (ОЖЖ) жұқтыруы және өлімге әкелетін менингит және энцефалит сияқты ауыр ауруларды тудыруы мүмкін, әсіресе иммунитеті төмендеген науқастарда9.Дегенмен, Toxoplasma gondii сонымен қатар иммунокомпетентті адамдарда жасуша өсуін және иммундық жауаптарды модуляциялау арқылы жұқтырған иесінің ортасын өзгерте алады, бұл симптомсыз созылмалы инфекцияның сақталуына әкеледі9,11.Бір қызығы, T. gondii таралуы мен ми ісігі жиілігі арасындағы корреляцияны ескере отырып, кейбір есептер созылмалы T. gondii инфекциясының салдарынан in vivo иесінің қоршаған ортасының өзгерістері ісік микроортасына ұқсайды деп болжайды.
Экзосомалар биологиялық мазмұнды, соның ішінде белоктар мен нуклеин қышқылдарын көрші жасушалардан жеткізетін жасушааралық коммуникаторлар ретінде белгілі16,17.Экзосомалар ісік микроортасында антиапоптоз, ангиогенез және метастаз сияқты ісікке байланысты биологиялық процестерге әсер етуі мүмкін.Атап айтқанда, миРНҚ (miRNAs), ұзындығы шамамен 22 нуклеотидті кодтамайтын шағын РНҚ-лар миРНҚ-индукцияланған дыбыссыздандыру кешені (miRISC) арқылы адам мРНҚ-ның 30%-дан астамын басқаратын маңызды посттранскрипциялық ген реттегіштері болып табылады.Toxoplasma gondii жұқтырған хосттардағы миРНҚ экспрессиясын бақылау арқылы биологиялық процестерді бұзуы мүмкін.Хост миРНҚ-ларында паразиттердің өмір сүру стратегиясына жету үшін хост биологиялық процестерін реттеуге арналған маңызды сигналдар бар.Осылайша, T. gondii жұқтырған кезде хост миРНҚ профиліндегі өзгерістерді зерттеу хост пен T. gondii арасындағы өзара әрекеттесуді нақтырақ түсінуге көмектеседі.Шынында да, Thirugnanam et al.15 T. gondii ісіктің өсуімен байланысты нақты хост миРНҚ-ларында экспрессиясын өзгерту арқылы мидың канцерогенезіне ықпал етеді деп ұсынды және T. gondii тәжірибелік жануарларда глиомаларды тудыруы мүмкін екенін анықтады.
Бұл зерттеу Toxoplasma BV2 жұқтырған микроглиядағы экзосомалық miR-21 өзгеруіне бағытталған.Біз шамадан тыс экспрессияланған miR-21 нысанасы болып табылатын FoxO1/p27 ядросының сақталуына байланысты U87 глиома жасушаларының өсуіндегі өзгерген экзосомалық miR-21 рөлін байқадық.
BV2-ден алынған экзосомалар дифференциалды центрифугалау арқылы алынды және жасушалық компоненттермен немесе басқа везикулалармен ластануды болдырмау үшін әртүрлі әдістермен расталды.SDS-полиакриламидті гель электрофорезі (SDS-PAGE) BV2 жасушаларынан алынған ақуыздар мен экзосомалар арасындағы айқын үлгілерді көрсетті (1А-сурет) және үлгілер Аликс бар-жоғына бағаланды, ол .Аликс таңбалауы экзосома ақуыздарында табылды, бірақ BV2 жасуша лизатының ақуыздарында табылмайды (1В-сурет).Сонымен қатар, биоанализер көмегімен BV2 алынған экзосомалардан тазартылған РНҚ талданды.18S және 28S рибосомалық суббірліктер экзосомалық РНҚ миграциясының үлгісінде сирек байқалды, бұл сенімді тазалықты көрсетеді (1С-сурет).Соңында трансмиссиялық электронды микроскопия байқалған экзосомалардың өлшемі шамамен 60-150 нм болатынын және экзосома морфологиясына тән шыныаяқ тәрізді құрылымға ие екенін көрсетті (1D-сурет).
BV2 жасушаларынан алынған экзосомалардың сипаттамасы.(A) Қауіпсіздік деректер парағының беті.Ақуыздар BV2 жасушаларынан немесе BV2 алынған экзосомалардан бөлініп алынды.Ақуыз үлгілері жасушалар мен экзосомалар арасында ерекшеленеді.(B) Экзосомалық маркердің Western Blot талдауы (Alix).(C) BV2 жасушаларынан және BV2 алынған экзосомалардан тазартылған РНҚ биоанализер көмегімен бағалау.Осылайша, BV2 жасушаларындағы 18S және 28S рибосомалық суббірліктер экзосомалық РНҚ-да сирек кездеседі.(D) Трансмиссиялық электронды микроскопия BV2 жасушаларынан бөлінген экзосомалар 2% уранилацетатпен теріс боялғанын көрсетті.Экзосомалар шамамен 60-150 нм өлшемді және шыныаяқ тәрізді (Сонг және Юнг, жарияланбаған деректер).
BV2-ден алынған экзосомалардың U87 адамның глиома жасушаларына жасушалық интериализациясы конфокальды микроскопияның көмегімен байқалды.PKH26 таңбаланған экзосомалар U87 жасушаларының цитоплазмасында локализацияланған.Ядролар DAPI-мен боялған (2А-сурет), бұл BV2-ден алынған экзосомаларды қабылдаушы жасушалармен интернационализациялай алатынын және алушы жасушалардың ортасына әсер ететінін көрсетеді.
BV2-туынды экзосомаларын U87 глиома жасушаларына және Toxoplasma RH жұқтырған BV2-туынды экзосомаларға ішке енгізу U87 глиома жасушаларының пролиферациясын тудырды.(A) Конфокальды микроскопиямен өлшенген U87 жасушаларымен жұтылатын экзосомалар.U87 глиома жасушалары PKH26 (қызыл) белгісі бар экзосомалармен немесе бақылаусыз 24 сағат бойы инкубацияланды.Ядролар DAPI (көк) бояумен боялған, содан кейін конфокальды микроскопта бақыланды (шкала жолағы: 10 мкм, x 3000).(B) U87 глиома жасушасының пролиферациясы жасуша пролиферациясының талдауымен анықталды.U87 глиома жасушалары көрсетілген уақыт ішінде экзосомалармен өңделген. *P < 0,05 Стьюденттің t тесті арқылы алынды. *P < 0,05 Стьюденттің t тесті арқылы алынды. *P < 0,05 Получено бойынша t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 Студенттің t-тесті бойынша. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Стьюденттің t-тестінің көмегімен алынған.
BV2-ден алынған экзосомалардың U87 глиома жасушаларына интернационализациясын растағаннан кейін, біз BV2-ден алынған токсоплазмадан алынған экзосомалардың адам глиома жасушаларының дамуындағы рөлін зерттеу үшін жасуша пролиферациясын талдадық.U87 жасушаларын T. gondii жұқтырған BV2 жасушаларының экзосомаларымен емдеу T. gondii жұқтырған BV2-ден алынған экзосомалар бақылаумен салыстырғанда U87 жасушаларының едәуір жоғары пролиферациясын тудырғанын көрсетті (2В-сурет).
Сонымен қатар, U118 жасушаларының өсуі U87 сияқты нәтижелерге ие болды, өйткені токсоплазманы ынталандыратын экзосомалар пролиферацияның ең жоғары деңгейін тудырды (деректер көрсетілмеген).Осы деректерге сүйене отырып, біз BV2-ден алынған токсоплазманы жұқтырған экзосомалар глиома жасушаларының пролиферациясында маңызды рөл атқаратынын көрсете аламыз.
Токсоплазмамен жұқтырған BV2 туынды экзосомаларының ісік дамуына әсерін зерттеу үшін біз U87 глиома жасушаларын ксеногрансплантат үлгісі үшін жалаңаш тышқандарға енгіздік және BV2 туынды экзосомаларын немесе RH жұқтырған BV2 туынды экзосомаларын енгіздік.Ісіктер 1 аптадан кейін айқын болғаннан кейін, 5 тышқанның әрбір эксперименттік тобы бірдей бастапқы нүктені анықтау үшін ісік өлшеміне сәйкес бөлінді және ісік өлшемі 22 күн бойы өлшенді.
U87 ксеногрансплантат үлгісі бар тышқандарда 22-ші күні BV2-ден алынған RH-инфекцияланған экзосомалар тобында ісік мөлшері мен салмағы айтарлықтай үлкенірек болды (Cурет 3A,B).Екінші жағынан, экзосомамен емдеуден кейін BV2-ден алынған экзосомалар тобы мен бақылау тобы арасында ісік өлшемдерінде айтарлықтай айырмашылық болған жоқ.Сонымен қатар, глиома жасушалары мен экзосомалар инъекцияланған тышқандар RH-инфекцияланған BV2 туынды экзосомалар тобындағы ең үлкен ісік көлемін визуалды түрде көрсетті (Cурет 3C).Бұл нәтижелер BV2 туындысы токсоплазмамен жұқтырған экзосомалар тышқан ісік үлгісінде глиоманың өсуін индукциялайтынын көрсетеді.
U87 ксенографиялық тінтуір үлгісіндегі BV2-ден алынған экзосомалардың онкогенезі (AC).BV2-ден алынған RH-инфекцияланған экзосомалармен өңделген BALB/c жалаңаш тышқандарда ісік мөлшері (A) мен салмағы (B) айтарлықтай өсті.BALB/c жалаңаш тышқандарға (C) Matrigel қоспасында суспензияланған 1 x 107 U87 жасушалары тері астына енгізілді.Инъекциядан кейін алты күннен кейін тышқандарда 100 мкг BV2 туынды экзосомалар өңделді.Ісік мөлшері мен салмағы сәйкесінше көрсетілген күндерде және құрбандық шалғаннан кейін өлшенді. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Деректер иммунитетке немесе ісіктің дамуына байланысты 37 миРНҚ (16 шамадан тыс және 21 төмендетілген) Toxoplasma RH штаммымен инфекциядан кейін микроглияда айтарлықтай өзгергенін көрсетті (4А-сурет).Өзгертілген miRNAs арасында miR-21 салыстырмалы экспрессия деңгейлері BV2 алынған экзосомалардағы, BV2 және U87 жасушаларымен өңделген экзосомалардағы нақты уақыттағы RT-ПТР арқылы расталды.miR-21 экспрессиясы Toxoplasma gondii (RH штаммы) жұқтырған BV2 жасушаларының экзосомаларының айтарлықтай өсуін көрсетті (4В-сурет).BV2 және U87 жасушаларында miR-21 салыстырмалы экспрессия деңгейлері өзгертілген экзосомаларды қабылдағаннан кейін жоғарылады (Cурет 4B).Toxoplasma gondii (ME49 штаммы) жұқтырған ісіктері бар науқастар мен тышқандардың ми тіндеріндегі miR-21 экспрессиясының салыстырмалы деңгейлері, тиісінше, бақылауларға қарағанда жоғары болды (4С-сурет).Бұл нәтижелер in vitro және in vivo болжанған және расталған микроРНҚ экспрессия деңгейлері арасындағы айырмашылықтармен корреляцияланады.
Toxoplasma gondii (RH) жұқтырған микроглиядағы экзосомалық miP-21a-5p экспрессиясының өзгеруі.(A) T. gondii RH инфекциясынан кейін иммунитетке немесе ісіктің дамуына байланысты siRNA-дағы елеулі өзгерістерді көрсетеді.(B) салыстырмалы miR-21 экспрессия деңгейлері BV2 туынды экзосомаларда, BV2 өңделген экзосомаларда және U87 жасушаларында нақты уақыттағы RT-ПТР арқылы анықталды.(C) MiR-21 экспрессиясының салыстырмалы деңгейлері ісік науқастарының (N=3) және Toxoplasma gondii (ME49 штаммы) жұқтырған тышқандардың ми тіндерінде табылды (N=3). *P < 0,05 Стьюденттің t тесті арқылы алынды. *P < 0,05 Стьюденттің t тесті арқылы алынды. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 Стьюденттің t-тестінің көмегімен алынды. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Стьюденттің t-тестінің көмегімен алынған.
RH-инфекцияланған BV2 жасушаларынан экзосомалар in vivo және in vitro жағдайында глиомалардың өсуіне әкелді (2, 3-сурет).Сәйкес mRNA-ларды анықтау үшін біз BV2 немесе RH BV2 алынған экзосомалармен жұқтырылған U87 жасушаларында ісікке қарсы мақсатты гендердің мРНҚ деңгейлерін, O1 (FoxO1), PTEN және бағдарламаланған жасуша өлімін (PDCD4) зерттедік.Биоинформатика талдауы бірнеше ісікпен байланысты гендердің, соның ішінде FoxO1, PTEN және PDCD4 гендерінде miR-2121,22 байланыстыру орындары бар екенін көрсетті.Ісікке қарсы мақсатты гендердің мРНҚ деңгейлері RH-инфекцияланған BV2-туынды экзосомаларда BV2-ден алынған экзосомалармен салыстырғанда төмендеді (5А-сурет).FoxO1 BV2-ден алынған экзосомалармен салыстырғанда RH-инфекцияланған BV2-туынды экзосомалардағы ақуыз деңгейінің төмендегенін көрсетті (5В-сурет).Осы нәтижелерге сүйене отырып, RH-инфекцияланған BV2-ден алынған экзосомалар ісіктердің өсуіндегі рөлін сақтай отырып, антионкогендік гендерді төмендететінін растай аламыз.
Toxoplasma RH жұқтырған BV2 туынды экзосомалар U87 глиома жасушаларында ісікке қарсы гендердің Toxoplasma RH жұқтырған BV2 туынды экзосомаларымен басылуын тудырады.(A) PBS экзосомаларымен салыстырғанда T. gondii RH жұқтырған BV2-ден алынған экзосомалардағы FoxO1, PTEN және PDCD4 экспрессиясының нақты уақыттағы ПТР.Бақылау ретінде β-актин мРНҚ пайдаланылды.(B) FoxO1 өрнегі Western blotting арқылы анықталды және денситометрия деректері ImageJ бағдарламасы арқылы статистикалық түрде бағаланды. *P < 0,05 Стьюденттің t тесті арқылы алынды. *P < 0,05 Стьюденттің t тесті арқылы алынды. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 Стьюденттің t-тестінің көмегімен алынды. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Стьюденттің t-тестінің көмегімен алынған.
Экзосомалардағы miP-21 ісікпен байланысты геннің реттелуіне әсерін түсіну үшін U87 жасушалары Lipofectamine 2000 көмегімен miP-21 тежегішімен трансфекцияланды және жасушалар трансфекциядан кейін 24 сағаттан кейін жиналды.miR-21 тежегіштерімен трансфекцияланған жасушалардағы FoxO1 және p27 экспрессия деңгейлері qRT-ПТР көмегімен BV2-туынды экзосомалармен өңделген жасушалармен салыстырылды (сурет 6A,B).miR-21 тежегішінің U87 жасушаларына трансфекциясы FoxO1 және p27 экспрессиясын айтарлықтай төмендетеді (6-сурет).
RH-инфекцияланған экзосомалық BV2-ден алынған miP-21 U87 глиома жасушаларында FoxO1/p27 экспрессиясын өзгертті.U87 жасушалары Lipofectamine 2000 көмегімен miP-21 тежегішімен трансфекцияланды және жасушалар трансфекциядан кейін 24 сағаттан кейін жиналды.miR-21 тежегіштерімен трансфекцияланған жасушалардағы FoxO1 және p27 экспрессия деңгейлері qRT-PCR (A, B) көмегімен BV2 туынды экзосомаларымен өңделген жасушалардағы деңгейлермен салыстырылды.
Хосттың иммундық реакциясынан құтылу үшін токсоплазма паразиті ұлпа кистасына айналады.Олар әртүрлі тіндерді, соның ішінде миды, жүректі және қаңқа бұлшықеттерін, иесінің бүкіл өмірінде паразиттік етеді және иесінің иммундық реакциясын модуляциялайды.Сонымен қатар, олар жасушалық циклді және хост жасушаларының апоптозын реттей алады, олардың көбеюіне ықпал етеді14,24.Toxoplasma gondii негізінен иенің дендритті жасушаларын, нейтрофилдерді және моноцит/макрофаг линиясын, соның ішінде ми микроглиясын зақымдайды.Toxoplasma gondii M2 фенотипінің макрофагтарының дифференциациясын индукциялайды, патогенді инфекциядан кейін жараның жазылуына әсер етеді, сонымен қатар гиперваскуляризациямен және гранулематозды фиброзбен байланысты.Токсоплазма инфекциясының бұл мінез-құлық патогенезі ісік дамуымен байланысты маркерлермен байланысты болуы мүмкін.Токсоплазмамен реттелетін дұшпандық орта тиісті ісік алды ауруға ұқсауы мүмкін.Сондықтан токсоплазма инфекциясы ми ісіктерінің дамуына ықпал етуі керек деп болжауға болады.Шындығында, әртүрлі ми ісіктері бар науқастардың сарысуында токсоплазма инфекциясының жоғары көрсеткіштері тіркелген.Сонымен қатар, Toxoplasma gondii басқа канцерогенді эффектор болуы мүмкін және басқа жұқпалы канцерогендердің ми ісіктерін дамытуға көмектесу үшін синергетикалық әрекет етуі мүмкін.Осыған байланысты, P. falciparum және Epstein-Barr вирусы Буркитт лимфомасының пайда болуына синергетикалық ықпал ететінін атап өткен жөн.
Қатерлі ісіктерді зерттеу саласында экзосомалардың реттеуші рөлі жан-жақты зерттелді.Дегенмен, паразиттер мен жұқтырған иелері арасындағы экзосомалардың рөлі әлі де аз зерттелген.Осы уақытқа дейін әртүрлі реттеушілер, соның ішінде секрецияланған ақуыздар, қарапайым паразиттердің хост шабуылына қарсы тұру және инфекцияны жалғастыру биологиялық процестерін түсіндірді.Жақында протозойлармен байланысқан микровезикулалар мен олардың микроРНҚ-лары олардың тіршілігіне қолайлы орта жасау үшін хост жасушаларымен өзара әрекеттеседі деген концепция өсуде.Сондықтан өзгерген экзосомалық миРНҚ-лар мен глиома жасушаларының пролиферациясы арасындағы байланысты анықтау үшін қосымша зерттеулер қажет.МикроРНҚ-ның өзгеруі (кластерлік гендер miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 және miR-17-92) токсоплазма жұқтырған адам макрофагтарындағы STAT3 промоторымен байланысады, реттеледі және антигенді индукциялайды. - Toxoplasma gondii инфекциясына жауап ретінде апоптоз 29 .Токсоплазмалық инфекция бірнеше гиперпролиферативті аурулармен байланысты miR-17-5p және miR-106b-5p экспрессиясын арттырады 30 .Бұл деректер Toxoplasma инфекциясымен реттелетін хост миРНҚ-лары паразиттердің өмір сүруі және биологиялық мінез-құлықтағы патогенез үшін маңызды молекулалар екенін көрсетеді.
Өзгертілген miRNA-лар қатерлі жасушалардың, соның ішінде глиомалардың инициациясы және прогрессиясы кезінде мінез-құлықтың әртүрлі түрлеріне әсер етуі мүмкін: өсу сигналдарының өзін-өзі қамтамасыз етуі, өсуді тежейтін сигналдарға сезімталдық, апоптоздан жалтару, шексіз репликативті потенциал, ангиогенез, инвазия және метастаз және қабыну.Глиомада өзгерген миРНҚ бірнеше экспрессиялық профильдеу зерттеулерінде анықталған.
Осы зерттеуде токсоплазма жұқтырған хост жасушаларында miRNA-21 экспрессиясының жоғары деңгейін растадық.miR-21 глиомаларды қоса, қатты ісіктердегі ең жиі шамадан тыс экспрессияланатын микроРНҚ-лардың бірі ретінде анықталды, 33 және оның экспрессиясы глиома дәрежесімен сәйкес келеді.Жинақталған дәлелдер miR-21 жаңа онкоген екенін көрсетеді, ол глиоманың өсуінде апоптозға қарсы фактор ретінде әрекет етеді және адам миының қатерлі ісіктерінің тіндері мен плазмасында шамадан тыс экспрессияланады.Бір қызығы, глиома жасушалары мен тіндеріндегі miR-21 инактивациясы каспазаға тәуелді апоптозға байланысты жасуша пролиферациясының тежелуін тудырады.miR-21 болжамды нысандарының биоинформатикалық талдауы миР-2121 байланыстыру орны бар бағдарламаланған жасуша өлімін 4 (PDCD4), тропомиозин (TPM1), PTEN және O1 (FoxO1) қоса алғанда, апоптоз жолдарымен байланысты көптеген ісіктерді басатын гендерді анықтады..22.38.
FoxO1, транскрипция факторларының (FoxO) бірі ретінде адам қатерлі ісігінің әртүрлі түрлерін дамытуға қатысады және p21, p27, Bim және FasL40 сияқты ісіктерді басатын гендердің экспрессиясын реттей алады.FoxO1 жасушаның өсуін басу үшін p27 сияқты жасушалық цикл ингибиторларын байланыстырады және белсендіреді.Сонымен қатар, FoxO1 PI3K/Akt сигналының негізгі эффекторы болып табылады және p2742 транскрипциясын белсендіру арқылы жасуша циклінің прогрессиясы мен жасушаның дифференциациясы сияқты көптеген биологиялық процестерді реттейді.
Қорытындылай келе, токсоплазма жұқтырған микроглиядан алынған экзосомалық miR-21 глиома жасушаларының өсу реттегіші ретінде маңызды рөл атқаруы мүмкін деп санаймыз (7-сурет).Дегенмен, экзосомалық miR-21, өзгерген токсоплазма инфекциясы және глиоманың өсуі арасындағы тікелей байланысты табу үшін қосымша зерттеулер қажет.Бұл нәтижелер токсоплазма инфекциясы мен глиома жиілігі арасындағы байланысты зерттеу үшін бастапқы нүкте болады деп күтілуде.
Бұл зерттеуде глиома (ми) канцерогенезінің механизмінің принципиалды диаграммасы ұсынылған.Автор PowerPoint 2019 бағдарламасында сурет салады (Microsoft, Redmond, WA).
Осы зерттеудегі барлық эксперименттік хаттамалар, соның ішінде жануарларды пайдалану, Сеул ұлттық университетінің Жануарларды күту және пайдаланушы комитетінің стандартты этикалық нұсқауларына сәйкес болды және Сеул Ұлттық университетінің Медицина мектебінің Институционалдық шолу кеңесімен (IRB нөмірі SNU-) мақұлданды. 150715).-2).Барлық эксперименттік процедуралар ARRIVE ұсыныстарына сәйкес жүргізілді.
BV2 тышқан микроглиясы және U87 адам глиома жасушалары тиісінше Дулбекконың өзгертілген бүркіт ортасында (DMEM; Welgene, Сеул, Корея) және Розуэлл Парк мемориалдық институтының ортасында (RPMI; Welgene) өсірілді, олардың әрқайсысында 10% ұрықтың ірі қара сарысуы, 4 мм- глютамин, 0,2 мМ пенициллин және 0,05 мм стрептомицин.Жасушалар 37°C температурада 5% СО2 бар инкубаторда өсірілді.Басқа глиома жасушаларының желісі, U118, U87 жасушаларымен салыстыру үшін пайдаланылды.
T. gondii жұқтырған RH және ME49 штаммдарынан экзосомаларды бөліп алу үшін T. gondii тахизоиттері (RH штаммы) 3-4 күн бұрын енгізілген 6 апталық BALB/c тышқандарының құрсақ қуысынан жиналды.Тахизоиттер үш рет PBS көмегімен жуылды және 40% Percoll (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, МО, АҚШ)43 центрифугалау арқылы тазартылды.ME49 штаммының тахизоиттерін алу үшін BALB/c тышқандарына 20 ұлпа кистасын құрсақ ішіне енгізді және инфекциядан кейін 6-8-ші күні құрсақ қуысын жуу арқылы кисталардағы тахизоит трансформациясы жиналды (PI).PBS жұқтырған тышқандар.ME49 тахизоиттері 100 мкг/мл пенициллинмен (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, АҚШ), 100 мкг/мл стрептомицинмен (Гибко/BRL) және 5% ұрықтың ірі қара сарысуымен (Лонза, Уолкерсвилл, MD) толықтырылған жасушаларда өсірілді. .., АҚШ) 37 °C және 5% көмірқышқыл газы.Веро жасушаларында өсіруден кейін ME49 тахизоиттері қоқыс пен жасушаларды жою үшін 25 калибрлі ине арқылы екі рет, содан кейін 5 мкм сүзгіден өтті.Жуғаннан кейін тахизоиттер PBS44-те қайта суспензияланды.Toxoplasma gondii ME49 штаммының ұлпа кисталары жұқтырған C57BL/6 тышқандарының (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Корея) миынан бөлінген кисталарды құрсақішілік инъекция арқылы ұсталды.ME49 жұқтырған тышқандардың миы 3 айлық PIден кейін жиналды және кисталарды оқшаулау үшін микроскоп астында ұсақталды.Ауру жұқтырған тышқандар Сеул ұлттық университетінің медицина мектебінде патогенсіз арнайы жағдайларда (SPF) ұсталды.
Жалпы РНҚ BV2 туынды экзосомаларынан, BV2 жасушаларынан және тіндерден miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) көмегімен өндірушінің нұсқауларына сәйкес, соның ішінде элюция сатысы үшін инкубация уақытын бөліп алды.РНҚ концентрациясы NanoDrop 2000 спектрофотометрінде анықталды.РНҚ микромассивтерінің сапасы Agilent 2100 биоанализаторы (Agilent Technologies, Amstelveen, Нидерланды) көмегімен бағаланды.
10% экзосомасы нашар FBS бар DMEM 4°C температурада 16 сағат бойы 100 000 г ультрацентрифугалау арқылы дайындалды және 0,22 мкм сүзгі арқылы сүзілді (Налгене, Рочестер, Нью-Йорк, АҚШ).BV2 жасушалары, 5 × 105, құрамында 10% экзосомамен жойылған FBS және 1% антибиотиктер 37°C және 5% CO2 бар DMEM-де өсірілді.24 сағат инкубациядан кейін жасушаларға RH немесе ME49 (MOI = 10) штаммының тахизоиттері қосылды және инвазияға ұшырамайтын паразиттер бір сағат ішінде жойылып, DMEM толтырылды.BV2 жасушаларынан экзосомалар ең көп қолданылатын әдіс модификацияланған дифференциалды центрифугалау арқылы оқшауланды.РНҚ немесе ақуызды талдау үшін экзосома түйіршіктерін 300 мкл PBS ішінде қайта суспензиялаңыз.Оқшауланған экзосомалардың концентрациясы BCA протеинін талдау жинағы (Пирс, Рокфорд, IL, АҚШ) және NanoDrop 2000 спектрофотометрі арқылы анықталды.
BV2 жасушаларынан алынған тұнбалар немесе BV2-ден алынған экзосомалар PRO-PREP™ ақуызды экстракциялау ерітіндісінде (iNtRon Biotechnology, Соннам, Корея) лизденді және ақуыздар Coomassie тамаша көк боялған 10% SDS полиакриламидті гельдерге жүктелді.Сонымен қатар, ақуыздар PVDF мембраналарына 2 сағатқа ауыстырылды.Вестерн дақтар экзосомалық маркер ретінде Alix антиденесінің (Cell Signaling Technology, Беверли, MA, АҚШ) көмегімен тексерілді.HRP-конъюгацияланған ешкі тінтуірге қарсы IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Монтгомери, TX, АҚШ) және LAS-1000 плюс люминесцентті кескін анализаторы (Fuji Photographic Film, Токио, Жапония) қосалқы антидене ретінде пайдаланылды..Экзосомалардың мөлшері мен морфологиясын зерттеу үшін трансмиссиялық электронды микроскопия жасалды.BV2 жасушаларынан оқшауланған экзосомалар (6,40 мкг/мкл) көміртегімен қапталған торларда дайындалды және 1 минут бойы 2% уранилацетатпен теріс боялады.Дайындалған үлгілер ES1000W Erlangshen CCD камерасымен жабдықталған JEOL 1200-EX II (Токио, Жапония) (Гатан, Плеасантон, CA, АҚШ) көмегімен 80 кВ үдеткіш кернеуде бақыланды.
BV2-ден алынған экзосомалар PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Oldrich, Сент-Луис, МО, АҚШ) көмегімен бөлме температурасында 15 минут бойы боялған.Теріс бақылау ретінде PKH26 таңбаланған экзосомасы (қызыл) немесе экзосомасы жоқ 2×105 U87 жасушалары 5% CO2 инкубаторында 37°C температурада 24 сағат бойы инкубацияланды.U87 жасуша ядролары DAPI (көк) бояумен боялған, U87 жасушалары 4% параформальдегидте 4°C температурада 15 минут бойы бекітілген, содан кейін Leica TCS SP8 STED CW конфокальды микроскоп жүйесінде (Leica Microsystems, Мангейм, Германия) талданған.байқалатын.
cDNA Mir-X siRNA бірінші тізбекті синтезі және SYBR qRT-PCR жинағы (Takara Bio Inc., Shiga, Жапония) көмегімен siRNA-дан синтезделді.Нақты уақыттағы сандық ПТР SYBR Premix араласқан праймерлер мен шаблондарды пайдалана отырып, iQ5 нақты уақыттағы ПТР анықтау жүйесі (Bio-Rad, Hercules, CA, АҚШ) арқылы орындалды.ДНҚ денатурацияның 40 циклі үшін 95°C температурада 15 секунд және жасыту үшін 60°C температурада 60 секунд күшейтілді.Әрбір ПТР реакциясының деректері iQ™5 оптикалық жүйе бағдарламалық құралының (Bio-Rad) деректерді талдау модулі арқылы талданды.Таңдалған мақсатты гендер мен β-актин/siRNA (және U6) арасындағы ген экспрессиясының салыстырмалы өзгерістері стандартты қисық әдіс арқылы есептелді.Пайдаланылған праймер тізбегі 1-кестеде көрсетілген.
3 x 104 U87 глиома жасушалары 96 шұңқырлы пластиналарға егілді және 12, 18 және 36 сағатта бақылау элементтері ретінде BV2 (50 мкг/мл) немесе BV2 (50 мкг/мл) алынған импульстік емес экзосомалар алынған токсоплазманы жұқтырған экзосомалармен араластырылды. .Жасушалардың көбею жылдамдығы Cell Counting Kit-8 (Дожиндо, Кумамото, Жапония) арқылы анықталды (Қосымша S1-S3 суреттері) 46 .
5 апталық ұрғашы BALB/c жалаңаш тышқандар Orient Bio компаниясынан (Соннам-си, Оңтүстік Корея) сатып алынды және бөлме температурасында (22±2°C) және ылғалдылықта (45±15°C) стерильді торларда жеке ұсталды.%) бөлме температурасында (22±2°C) және ылғалдылықта (45±15%).SPF (Сеул ұлттық университетінің медицина мектебінің жануарлар орталығы) аясында 12 сағаттық жарық циклі және 12 сағаттық қараңғы цикл орындалды.Тышқандар кездейсоқ түрде әрқайсысы 5 тышқаннан тұратын үш топқа бөлінді және барлық топтар тері астына 1 x 107 U87 глиома жасушалары және өсу факторы төмендеген BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, АҚШ) бар 400 мл PBS енгізілді.Ісік инъекциясынан кейін алты күннен кейін ісік аймағына BV2 жасушаларынан алынған 200 мг экзосомалар (токсоплазма инфекциясы бар/жоқ) енгізілді.Ісік жұқтырғаннан кейін жиырма екі күн өткен соң, әр топтағы тышқандардың ісік өлшемі аптасына үш рет штангенциркульмен өлшеніп, ісік көлемі мына формула бойынша есептелді: 0,5×(ені)×2×ұзындығы.
miRCURYTM LNA miRNA массивін қолданып MicroRNA экспрессиясын талдау, 7-буында mmu және rno массивтері бар (EXIQON, Vedbaek, Дания) 3100 адам, тінтуір және егеуқұйрық миРНҚ түсіру зондтарының арасында жақсы сипатталған 1119 тышқанды қамтиды.Бұл процедура барысында 5′-фосфаттан 250-ден 1000 нг дейінгі жалпы РНҚ бұзау ішек сілтілі фосфатазасымен өңдеу арқылы, содан кейін Hy3 жасыл флуоресцентті бояумен таңбалау арқылы жойылды.Содан кейін таңбаланған үлгілер гибридтеу камерасының жинағы (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, АҚШ) және гибридтеу слайдтары жинағы (Agilent Technologies) арқылы микромассив слайдтарын жүктеу арқылы будандастырылды.Гибридтеу 56°С температурада 16 сағат бойы жүргізілді, содан кейін өндірушінің ұсыныстарына сәйкес микромассивтер жуылды.Содан кейін өңделген микромассив слайдтары Agilent G2565CA микромассив сканер жүйесі (Agilent Technologies) арқылы сканерленді.Сканерленген кескіндер Agilent Feature Extraction бағдарламалық құралының 10.7.3.1 (Agilent Technologies) нұсқасының көмегімен импортталды және әр кескіннің флуоресценция қарқындылығы өзгертілген Exiqon протоколының сәйкес GAL файлы арқылы сандық анықталды.Ағымдағы зерттеуге арналған микромәліметтер GEO дерекқорында GPL32397 қосылу нөмірімен сақталады.
Токсоплазманы жұқтырған RH немесе ME49 штаммдарының микроглияларындағы жетілген экзосомалық miRNA-лардың экспрессиялық профильдері әртүрлі желілік құралдарды қолдану арқылы талданды.Ісік дамуымен байланысты miRNAs miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) көмегімен анықталды және 8,0-ден жоғары қалыпты сигнал қарқындылығымен (log2) сүзгіден өтті.miRNAs арасында дифференциалды түрде экспрессияланған miRNAs T. gondii жұқтырған RH немесе ME49 штаммдарымен өзгертілген миРНҚ сүзгі талдауы арқылы 1,5 еседен астам өзгергені анықталды.
Жасушалар Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, АҚШ) көмегімен opti-MEM (Гибко, Карлсбад, CA, АҚШ) алты шұңқырлы тақталарға (3 x 105 ұяшық/ұңғыма) себілді.Трансфекцияланған жасушалар 6 сағат бойы өсірілді, содан кейін орта жаңа толық ортаға ауыстырылды.Жасушалар трансфекциядан кейін 24 сағаттан кейін жиналды.
Статистикалық талдау негізінен Excel бағдарламасымен (Microsoft, Вашингтон, АҚШ, АҚШ) Стьюденттің t-тестінің көмегімен орындалды.Тәжірибелік жануарларды талдау үшін Prism 3.0 бағдарламалық құралының көмегімен екі жақты ANOVA орындалды (GraphPad Software, La Jolla, CA, АҚШ). P-мәндері < 0,05 статистикалық маңызды деп саналды. P-мәндері < 0,05 статистикалық маңызды деп саналды. Значения P <0,05 статистические значими. P <0,05 мәндері статистикалық маңызды деп саналды. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 статистические значими. P <0,05 мәндері статистикалық маңызды деп саналды.
Осы зерттеуде пайдаланылған барлық эксперименттік хаттамаларды Сеул Ұлттық Университетінің Медицина мектебінің Институционалдық шолу кеңесі (IRB нөмірі SNU-150715-2) бекітті.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Фурли, Дж. және т.б.2018 жылы болжамды жаһандық қатерлі ісік ауруы мен өлім-жітім: GLOBOCAN көздері мен әдістері.Түсіндіру.Дж. Рак 144, 1941–1953 (2019).
Рашид, С., Рехман, К. және Акаш, MS Ми ісіктерінің қауіп факторлары және олардың терапиялық араласулары туралы түсінік. Рашид, С., Рехман, К. және Акаш, MS Ми ісіктерінің қауіп факторлары және олардың терапиялық араласулары туралы түсінік.Рашид, С., Рехман, К. және Акаш, MS Ми ісіктері мен негізгі терапевтік араласулардың қауіп факторларына шолу. Рашид, С., Рехман, К. және Акаш, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Рашид, С., Рехман, К. және Акаш, MS Ми ісігінің қауіп факторлары мен терапевтік араласуларын терең түсіну.Рашид, С., Рехман, К. және Акаш, MS Ми ісіктері мен негізгі терапевтік араласулардың қауіп факторларына шолу.Биомедициналық ғылым.Фармацевт.143, 112119 (2021 ж.).
Като, И., Чжан, Дж. және Сун, Дж. Адамның асқазан-ішек және әйел жыныс жолдарының қатерлі ісігіндегі бактериялық-вирустық өзара әрекеттесу: эпидемиологиялық және зертханалық дәлелдемелердің қысқаша мазмұны. Като, И., Чжан, Дж. және Сун, Дж. Адамның асқазан-ішек және әйел жыныс жолдарының қатерлі ісігіндегі бактериялық-вирустық өзара әрекеттесу: эпидемиологиялық және зертханалық дәлелдемелердің қысқаша мазмұны.Като И., Чжан Дж. және Сун Дж. Адамның асқазан-ішек жолдары мен әйел жыныс жолдарының қатерлі ісігіндегі бактериялық-вирустық өзара әрекеттесу: эпидемиологиялық және зертханалық деректердің қысқаша мазмұны. Като, И., Чжан, Дж. және Сун, Дж. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：北毒相互作用:据总结。 Като, И., Чжан, Дж. және Сун, Дж. Адамның ауыз қуысының ас қорытуындағы және әйелдердің ұрпақты болу жолындағы бактерио-вирустық өзара әрекеттесу: танымал ауру ғылымының қысқаша мазмұны және зертханалық дәлелдер.Като И., Чжан Дж. және Сун Дж. Адамның асқазан-ішек қатерлі ісігіндегі және әйел жыныс мүшелерінің қатерлі ісігіндегі бактериялық-вирустық өзара әрекеттесу: эпидемиологиялық және зертханалық деректердің қысқаша мазмұны.Қатерлі ісік 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Инфекциядан қатерлі ісікке дейін: ДНҚ ісік вирустары жасушаның орталық көміртегі мен липидтер алмасуын қалай өзгертеді. Magon, KL & Parish, JL Инфекциядан қатерлі ісікке дейін: ДНҚ ісік вирустары жасушаның орталық көміртегі мен липидтер алмасуын қалай өзгертеді.Mahon, KL және Parish, JL Қатерлі ісікке өрт инфекциясы: ДНҚ негізіндегі ісік вирустары жасушаның орталық көміртегі мен липидтер алмасуын қалай өзгертеді. Magon, KL & Parish, JL. Magon, KL & Parish, JL Инфекциядан қатерлі ісікке дейін: ДНҚ ісік вирустары жасушаның орталық көміртегі мен липидтер алмасуын қалай өзгертеді.Mahon, KL және Parish, JL Қатерлі ісікке қарсы инфекция: ДНҚ ісік вирустары қабылдаушы жасушалардағы орталық көміртегі мен липидтер алмасуын қалай өзгертеді.Ашық биология.11, 210004 (2021 ж.).
Коррейа да Коста, Дж.М. және т.б.Шистосомалардың катехол эстрогендері және бауыр лимфалары және гельминтпен байланысты қатерлі ісік.алдыңғы.іші ыстық.5, 444 (2014 ж.).